荧光免疫技术
免疫荧光技术名词解释细胞生物学
一、免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种通过荧光显微镜观察细胞或组织中特定分子的方法。
它利用抗体与待检测分子结合后，再加上荧光标记的二抗或荧光标记的直抗，通过荧光显微镜观察标记分子的位置和数量。
免疫荧光技术在细胞生物学和免疫学研究中得到了广泛应用，为研究生物分子的定位、表达和相互作用提供了重要技术支持。
二、免疫荧光技术的原理1. 抗体结合在免疫荧光技术中，首先需要用特异性抗体与待检测的分子结合。
这些抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，通过它们与目标分子的结合，实现对待检测分子的高度特异性识别。
2. 荧光标记待检测分子与抗体结合后，需要加入荧光标记的二抗或直抗，使得待检测分子与荧光物质结合形成复合物。
通常使用的荧光分子有FITC、TRITC、Alexa Fluor等，它们在不同激发波长下显示出不同的荧光颜色。
3. 观察和分析最后通过荧光显微镜观察标记的细胞或组织样品，根据荧光信号的强度和分布情况，可以判断待检测分子的位置和数量，从而了解其在细胞内的表达和功能。
三、免疫荧光技术的应用1. 细胞膜标记免疫荧光技术可用于标记细胞膜上的特定蛋白，例如细胞黏附蛋白、受体蛋白等，从而观察它们在细胞膜上的分布情况和动态变化，揭示细胞膜的结构和功能。
2. 细胞器定位通过标记特定的蛋白或抗体，免疫荧光技术可以用于观察细胞器的定位，如线粒体、内质网、高尔基体等，帮助研究者了解细胞器在细胞内的分布和相互作用。
3. 蛋白相互作用免疫荧光技术也被广泛应用于研究蛋白之间的相互作用关系，通过标记不同的蛋白并观察它们在细胞内的共定位情况，可以揭示蛋白间的相互作用网络和信号传导路径。
4. 细胞功能研究通过观察细胞内荧光标记物的动态变化，免疫荧光技术可以帮助研究者了解细胞的代谢活动、信号转导和细胞周期等重要的生物学过程。
四、免疫荧光技术的发展和趋势1. 自动化和高通量随着技术的发展，免疫荧光技术已经向自动化和高通量方向发展。
自动化的设备和流程使得实验操作更加标准和高效，而高通量的技术则可以同时观察大量样品，加快研究进程。
荧光免疫标记技术
荧光染料的选择与特性
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荧光染料种类
常见的荧光染料包括异荧光染料特性
不同的荧光染料具有不同的激 发波长和发射波长，可选择适 用于不同检测需求的染料。
荧光染料标记方式
荧光染料稳定性
荧光染料可以通过化学键合、 生物素-亲和素系统等方式与抗 体或抗原结合。
反应条件控制
为了确保抗原-抗体反应的顺利进行，需要控制适宜的反应条件， 如温度、pH值和离子强度等。这些条件会影响抗原和抗体的活性 以及它们之间的结合能力。
荧光染料的标记与染色
选择合适的荧光染料
根据实验需求选择具有特定波长的荧光染料，以便在检测时能够产生明显的荧 光信号。荧光染料应具有高灵敏度、低背景干扰和稳定性好的特点。
标记抗原或抗体
将荧光染料与抗原或抗体结合，形成带有荧光的标记物。标记的过程可以通过 化学方法或生物技术实现，确保荧光染料与抗原或抗体牢固结合。
结果观察与数据分析
荧光显微镜观察
通过荧光显微镜观察抗原-抗体复合物的荧光信号，可以定性或定量分析样本中 的抗原含量。观察时需注意控制激发波长和发射波长，以获得最佳的荧光信号。
数据分析
利用相关软件对荧光信号进行定量分析，通过测量荧光强度、荧光分布和荧光色 彩等信息，计算抗原浓度或细胞数量等指标。数据分析有助于提高实验结果的准 确性和可靠性。
04
荧光免疫标记技术的优缺点
优点
高灵敏度
荧光免疫标记技术能够检测到低浓度的抗原或抗 体，具有较高的灵敏度。
特异性高
荧光免疫标记技术通常采用特异性的抗体或抗原 ，能够针对特定的目标进行检测，具有较高的特 异性。
流式细胞术
利用荧光免疫标记技术对细胞 表面抗原进行标记，通过流式 细胞仪进行检测和分析，可以 对细胞进行分群、计数和功能 研究。
免疫荧光技术(immunofluorescent technique)简介
免疫荧光技术(immunofluorescent technique)简介1、荧光免疫测定技术的概念将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。
2、技术分类（1）荧光抗体技术（荧光显微镜技术）：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。
（2）免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。
3、荧光的产生物质吸收外界能量而进入激发状态，在恢复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。
这种物质，称为荧光素。
由光激发所引起的荧光，为光致荧光------荧光免疫技术；由化学反应所引起的荧光，为化学荧光------化学发光技术。
4、荧光素的荧光特性（1）停止供能，荧光现象随即终止。
（2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性。
入射光波长<发射光波长。
（3）荧光效率：发射荧光的光量子数荧光效率=---------------------------吸收光的光量子数（4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱。
5、常见荧光素及其特性（1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光490~495nm，发射光520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
（2）RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
（3）TRITC：紫红色粉末，吸收光550nm，发射光620nm，橙红色荧光。
（4）镧系：Eu3+、Tb3+等。
（5）PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。
（6）其它：酶作用后产生荧光物质，具体如下表：酶底物产物激发光发射光B-G MUG MU 360 450AP MUP MU 360 450HRP HPA 二聚体 317 4146、合适荧光素的选择（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
荧光素-N=C +NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质‖ ���颉���S H H S H（2）荧光效率高，标记后下降不明显。
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤免疫荧光技术（immunofluorescence）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，它通过利用抗体与特定抗原结合后对细胞或组织中的抗原进行标记，然后利用荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
本文将介绍免疫荧光技术的原理和步骤，帮助读者更好地了解和应用这一技术。
原理。
免疫荧光技术的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
当特异性抗体与其相应的抗原结合后，可以利用荧光染料标记抗体，使其在荧光显微镜下发出特定颜色的荧光信号。
这样就可以通过观察荧光信号的位置和强度来确定抗原在细胞或组织中的分布情况。
步骤。
免疫荧光技术的步骤通常包括样品处理、抗体标记、荧光染料标记和观察四个主要步骤。
1. 样品处理。
样品处理是免疫荧光技术的第一步，它包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定是为了保持细胞或组织的形态结构和抗原的稳定性，常用的固定剂包括乙醇、乙酸和乙醛等。
脱水和透明化则是为了使样品透明，便于观察。
2. 抗体标记。
抗体标记是免疫荧光技术的关键步骤，它需要选择特异性较好的一抗和二抗。
一抗是直接与抗原结合的抗体，而二抗是与一抗结合的抗体。
在这一步骤中，需要将一抗和二抗分别标记上荧光染料。
3. 荧光染料标记。
荧光染料标记是将标记好荧光的抗体与样品中的抗原结合，形成荧光信号。
这一步骤需要在暗处进行，以避免荧光信号受到光照的干扰。
4. 观察。
观察是免疫荧光技术的最后一步，通过荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
在观察过程中，需要根据实验设计选择合适的荧光滤光片，以获得清晰的荧光图像。
总结。
免疫荧光技术是一种重要的生物医学研究和临床诊断技术，它通过标记抗体和抗原来观察细胞或组织中特定蛋白的位置和分布情况。
掌握免疫荧光技术的原理和步骤，可以帮助科研工作者和临床医生更好地开展相关工作，为生物医学领域的发展做出贡献。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
关于荧光免疫技术详细介绍
关于荧光免疫技术详细介绍荧光免疫技术是一种基于抗体-抗原反应原理的分析方法，利用荧光染料标记的抗体或抗原与靶标结合后，通过测量荧光信号的强度来检测和定量分析靶标物质。
荧光免疫技术的原理主要包括标记物准备、信号检测和结果分析三个方面。
首先，需要将抗体或抗原与荧光染料标记结合，一般通过共价键合、生物素-链霉亲和素体系或其他化学反应进行标记。
标记物的选择应该满足荧光发射波长范围广、发射光强、稳定性好等要求。
然后，标记物与待检测样品中的靶标物质结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，通过荧光检测仪器，测量荧光信号的强度，并将其转化为定量结果。
荧光免疫技术具有以下优势：首先，荧光信号强度大，可以实现高灵敏度的检测。
其次，荧光染料具有多样化的波长特性，可以实现多通道的同时测量。
此外，荧光免疫技术还具有选择性高、重复性好、灵敏度高、分析速度快、自动化程度高的特点。
荧光免疫技术在医学、生物学和环境监测等领域有广泛的应用。
在医学上，荧光免疫技术可以用于疾病的早期诊断和预防，如肿瘤标记物检测、感染病原体的检测和体液中特定蛋白质的定量等。
在生物学研究中，荧光免疫技术可以用于检测细胞和分子的定位、定量和相互作用等。
在环境监测中，荧光免疫技术可以用于检测污染物、重金属和有害物质等。
衡量荧光免疫技术的指标主要包括检测灵敏度、检测限、特异性、线性范围、准确性和重现性等。
检测灵敏度是指该技术能够检测到的最低浓度，一般以荧光信号的强度来表示。
检测限是指能够可靠地检测到的最低浓度，一般是指信号与噪声之间的差异。
特异性是指该技术与其他分子之间的交叉反应能力。
线性范围是指该技术在一定浓度范围内与浓度之间的线性关系。
准确性是指该技术的结果与真实值之间的接近程度。
重现性是指该技术在相同条件下的重复实验结果的一致度。
在实际应用中，荧光免疫技术还可以与其他技术相结合，如酶标记技术、化学发光技术等，以扩大分析范围和提高灵敏度。
同时，随着荧光探针和检测仪器的不断发展，荧光免疫技术将会不断创新和完善，为医学和生物科学研究提供更多的选择和便利。
医学免疫学荧光免疫技术资料
荧光(yíngguāng)抗体
• 荧光抗体(kàngtǐ)染色技术中常用的标记荧光物质
异硫氰酸荧光素 （FITC）
最大吸收 (xīshōu)波长
495nm
最大发射波长 525nm，黄绿色
四乙基罗丹明 （RB200）
570nm
595nm，红色
四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC）
550nm
的荧光 • 非特异性荧光 • 背景荧光 • 洗涤不彻底，荧光抗体非特异性吸附
第九页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体染色法
• 技术类型 • 直接法 • 间接(jiàn jiē)法 • 补体结合法 • 双标记法
第十页，共18页。
• 原理(yuánlǐ)
直接(zhíjiē)法
荧光 荧光抗体
待测标本
第三页，共18页。
基质(jī zhì)片
• 将标本固定在玻片上而形成，含有已知或待测抗原 • 根据标本来源不同可分为 • 组织印片、组织切片(qiē piàn)、细胞涂片、细菌涂片 • 制备好的基质片应尽快染色或置－20℃保存
第四页，共18页。
荧光(yíngguāng)抗体
• 用化学的方法将荧光物质共价连接在抗体上而形成 • 荧光的基本知识 • 自然界某些物质能从外界吸收(xīshōu)能量（光能、化学能），
基本概念
• 抗原抗体反应具有高度特异性
• 荧光物质的检测具有灵敏性和直观性
• 荧光免疫技术是将两者有机的结合起来
• 将荧光物质与抗原（抗体）连接(liánjiē)，形成荧光标记物
• 再与相应的抗体（抗原）发生反应，检测反应体系中的荧光 强弱及存在部位用于物质的定性、定量、定位检测
• 按技术原理及用途分为
免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。
在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。
根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
三、基本实验步骤：1、细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。
PBS洗涤3×5 min.3、通透。
使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
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二、标记抗体的纯化
目的 去除未结合的游离荧光素
去除过度标记的蛋白 去除非特异反应抗体
方法
透析法 将标记物置于透析袋中透析；适 用于蛋白含量低的标记物 凝胶过滤法
常用Sephadex G50凝胶，洗脱第 一峰为结合蛋白峰，第二峰为荧光素 峰。
离子交换层析法 依次洗脱下来的成分是未结合荧 光素的抗体、荧光标记合适的抗体、
亮黄绿色 最广泛
桔红色 橙红色 常用于双重标记或 对比染色 衬染或单独染色, 荧光猝灭速度慢 与FITC一起用于 双色免疫荧光染色, 共用488nm波长
藻红色
其他荧光物质
镧系螯合物 如 Eu3+ 等
酶作用后产生荧光的物质
如: 4甲基伞酮-β-D半乳糖苷
β-半乳糖苷酶 4甲基伞酮
荧光免疫分析常用的仪器和设备
荧光偏振
P=
FH-FL FH+FL
P=0说明完全不偏振，-1<P<1为部分偏振
荧光物质
最大吸收 最大发射 波长(nm) 波长(nm) 异硫氰酸荧 490~495 520~530 光素(FITC) 570 595~600 四乙基罗丹 明(RB200) 550 620 四甲基异硫 氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白 (R-RE) 565 578 名 称 荧光颜色 应 用
试剂
95% 乙醇、甲醇、丙酮、 10% 福 尔马林等。
二、荧光抗体染色
目的： 使荧光抗体与待观察的抗原
结合，达到示踪效果。
步骤：于已固定的标本上滴加经适
当稀释的荧光抗体，25~37℃湿盒 反应30分钟，用PBS洗涤，缓冲甘 油封片。
直接法
荧光标记抗体 抗原
间接法
荧光标记抗体 特异抗体 抗原
三、荧光显微镜检查
光源
荧光素-Ab+Ag
荧光素-Ab-Ag 荧光显微镜观察
主 要 内 容
荧光的基础知识 荧光抗体的制备
免疫荧光显微技术 在医学检验中的应用
荧光的基础知识
荧光
某些物质受到一定波长光激发后，在Байду номын сангаас 短时间内发射出波长大于激发光波长的光。
荧光产生机制
一些化学物质 基态
吸收并储存能量
激发态
发光
发射光谱
指固定激发光波长，在不同波长 下所记录到的样品发射荧光的强度。
过量结合荧光素的抗体。
肝粉吸收法
用于去除交叉反应抗体或非期
望抗体等非特异反应抗体。
三、荧光抗体的鉴定 1. 抗体效价
抗体效价可用琼脂双扩法进 行滴定，效价大于1:16较为理想。
2.荧光素与蛋白质的结合比率（F/P）
将制备的荧光抗体稀释至A280≈ 1.0，
分别测读A280（蛋白质特异性吸收峰） 和标记荧光素的特异吸收峰，按公式 计算。
透光范围410~650nm，有OG
(橙黄色)和GG(淡绿黄色)两种。
荧光抗体的制备
荧光抗体 荧光素与特异性
抗体以化学共价键的方式结合而成。
荧光抗体的制备
一、抗体与荧光素的结合
二、标记抗体的纯化 三、荧光抗体的鉴定
一、抗体与荧光素的结合
对抗体的要求：
1 2 3 用于标记的抗体，是高特异性和高 亲和力的； 所用抗血清中不应含有针对标本中 正常组织的抗体； 一般需经纯化提取IgG后再作标记。
（FITC）F/P=
（RB200）F/P =
2.87×A495 A280-0.35×A495
A515 A280
F/P值越高，说明抗体分子上结合的
荧光素越多，反之越少。一般用于固定标 本的荧光抗体以F/P=1.5为宜，用于活细 胞染色的以F/P=2.4为宜。
免疫荧光显微技术
基本原理：
荧光抗体 - 抗原（组织或细胞）
激发光谱
指固定检测波长，用不同波长 的激发光激发样品所记录到的相应 的荧光发射强度。
荧光效率
荧光效率=
发射荧光的光量子数(荧光强度)
吸收光的光量子数(激发光强度)
荧光寿命
指荧光物质被一瞬时光脉冲激发 后产生的荧光随时间而衰减到一定程 度时所用的时间。
荧光的猝灭
指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发 光较长时间的照射后会发生减弱的现象。
物稳定，易于保存。
5 标记方法简单、安全无毒。
抗体标记荧光素常用方法
1. 搅拌法 待标记蛋白
缓慢滴加荧光素
室温持续搅拌4~6小时
离心
上清即为标记物
该法适用于标记体积较大，蛋白
含量较高的抗体溶液。
优点： 标记时间短，荧光素用量少。 缺点：本法的影响因素多，若操作不
当会引起较强的非特异性荧光染色。
2.透析法
作为标记的荧光素应符合以下要求
1 具有能与蛋白质分子形成共价键的
化学基团，与蛋白质结合后不易解
离，而未结合的色素及其降解产物
易于清除。
2 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍
能保持高的荧光效率。
3 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 4 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的 生化与免疫学性质，与蛋白质的结合
荧光显微镜 荧光分光光度计
流式细胞仪
荧光显微镜
光 源 高压汞灯、氙灯或卤素灯 激发光类型
紫外光（UV系统，UG） 兰紫光（BV系统，BG） 透射光 落射光
光路
滤 板
隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔热。
激发滤板：提供合适的激发光谱。BG只
允许325~ 500nm波段通过，
最大透光度在410nm。
吸收滤板：滤除激发光而只允许荧光通过。
蛋白质 荧光素缓冲液
荧光素标记蛋白质 PBS
适用于标记量少，蛋白含量低的抗体溶液。
特点: 标记较均匀，非特异性染色也较低。
影响荧光素与抗体结合的因素
1 PH值：常用PH7.4 ～8磷酸缓冲液及
PH9 ～9.5碳酸盐缓冲液。
2 温 度：常用20℃～25℃，大于25℃有
猝灭作用。
3 荧光素与蛋白的浓度比例： 最适为1:100～1:150 4 猝灭剂的影响
荧光显微镜观察
一、标本的制作
常见临床标本：组织、细胞、细菌 制作成的标本：切片、涂片、印片
要求：
保持抗原的完整性； 保持抗原的定位性；
标本切片尽量薄，以利于抗原抗体
充分接触以及镜检； 尽量除去影响抗原抗体反应的物质。
标本的固定
目的
（ 1 ）防止细胞或切片从玻片上脱落； （2）除去组织中妨碍抗原抗体结合 的类脂质； （3）易于保存。
荧光免疫技术
彭晓东
概 念
荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）
将免疫学反应的特异性与荧光技术
的敏感性结合起来的一种方法。 荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）
以荧光物质标记抗体进行抗原定位的技术。
特 点
直观
定位性
快速、敏感
传统荧光抗体技术的基本原理