体外细胞实验方法
体外细胞活性实验报告
一、实验目的本实验旨在探究不同浓度药物对细胞活性的影响，通过体外细胞培养和细胞活性检测方法，评估药物对细胞增殖的影响，为药物筛选和作用机制研究提供实验依据。
二、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞（HEK293）。
2. 药物：实验药物A、B、C。
3. 培养基：DMEM培养基（含10%胎牛血清）。
4. 试剂：胰蛋白酶、MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化物）、DMSO（二甲基亚砜）等。
5. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、离心机等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于培养皿中，置于CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，进行药物处理实验。
2. 药物处理：将实验药物A、B、C分别用DMSO溶解，配制成不同浓度（0、10、20、40、80、160、320 μg/mL）的药物溶液，分别加入培养皿中的细胞中，每组设3个复孔，培养24小时。
3. MTT检测：将药物处理后的细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞密度为1×10^5个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24小时。
向每个孔中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4小时。
加入150 μL DMSO，充分溶解蓝紫色结晶，用酶标仪测定各孔吸光度（OD）值。
4. 数据分析：采用GraphPad Prism软件进行统计分析，比较不同浓度药物对细胞活性的影响。
四、实验结果1. 不同浓度药物对HEK293细胞活性的影响：随着药物浓度的增加，药物A、B、C 对HEK293细胞的抑制作用逐渐增强。
其中，药物A在320 μg/mL浓度下对细胞活性抑制率最高，约为90%；药物B在160 μg/mL浓度下对细胞活性抑制率最高，约为70%；药物C在80 μg/mL浓度下对细胞活性抑制率最高，约为50%。
2. 不同浓度药物对细胞生长曲线的影响：随着药物浓度的增加，药物A、B、C对HEK293细胞的生长曲线逐渐下降，表明药物对细胞增殖具有抑制作用。
体外皮肤变态反应 U937细胞激活试验方法
体外皮肤变态反应U937细胞激活试验方法U937Cell Line Activation Test1范围本方法规定了体外皮肤变态反应U937细胞激活试验的基本原则、要求和方法。
本方法适用于化妆品用化学原料潜在致敏性的评价。
2试验目的本试验用于检测体外培养的人组织细胞淋巴瘤细胞表面标记物CD86的表达变化，以评价受试物引起皮肤变态反应的可能性。
3定义3.170%细胞存活率浓度值70%cell viability（CV70）受试物染毒后，细胞存活率为70%时对应的受试物浓度值。
3.2刺激指数stimulation index（S.I.）与溶剂对照相比，扣除同型对照后流式细胞仪测定的受试物阳性细胞相对强度值。
3.3CD86有效作用浓度值Effective Concentration150（EC150）CD86的相对荧光强度值达到150时对应的受试物浓度值。
4试验的基本原则当致敏物质接触皮肤后，树突状细胞在移动到淋巴器官的过程中分化成熟，并上调一系列表面分子的表达。
体外培养类树突状细胞：人组织细胞淋巴瘤细胞，并和受试物共暴露48h后，使用荧光抗体染料对细胞表面分子CD86染色并用流式细胞仪测定，从而评价受试物是否具有致敏性。
5试剂5.1细胞选用人组织细胞淋巴瘤细胞（The human histiocytic lymphoma cell line，U937细胞）。
细胞使用前应进行稳定性检测。
推荐使用clone CRL1593.2细胞株。
5.2培养基RPMI1640基础培养液中加入10%胎牛血清、适量抗生素，配制成1640完全培养基。
5.3染色缓冲液磷酸盐缓冲液中加入5%的胎牛血清。
5.4染料和抗体类物质7-氨基放线素菌-D染料（7-AAD）或碘化丙啶（propidium iodide,PI）FITC标记的小鼠单克隆CD86抗体（FITC-CD86）FITC标记的小鼠IgG1（FITC-IgG1）6试验方法6.1细胞准备6.1.1细胞培养U937悬浮细胞使用1640完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养，倒置显微镜下观察细胞状态。
动物试验_体外实验报告
一、实验目的本研究旨在探讨某种新型抗肿瘤药物在体外细胞模型中的抗肿瘤活性，为该药物的临床应用提供实验依据。
二、实验材料1. 细胞：人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系SGC-7901、人乳腺癌细胞系MCF-7。
2. 药物：新型抗肿瘤药物，以DMSO溶解，浓度为1000μM。
3. 主要试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT试剂、二甲基亚砜（DMSO）、细胞计数试剂盒等。
4. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、离心机等。
三、实验方法1. 细胞培养：将人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系SGC-7901、人乳腺癌细胞系MCF-7分别接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 药物处理：将培养至对数生长期的细胞以1×104个/孔接种于96孔板，分别加入不同浓度的药物（0μM、10μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM）处理，每组设6个复孔。
同时设置空白对照组和DMSO对照组。
3. MTT法检测细胞增殖：药物处理48小时后，每孔加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。
然后加入150μl DMSO，在酶标仪上测定各孔吸光度（OD）值。
4. 统计分析：采用SPSS 22.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05为差异具有统计学意义。
四、实验结果1. 不同浓度药物对三种肿瘤细胞增殖的影响：随着药物浓度的增加，三种肿瘤细胞的增殖活性均受到抑制。
其中，在50μM和100μM浓度下，A549、SGC-7901和MCF-7细胞的增殖活性显著降低（P<0.05）。
2. 不同浓度药物对三种肿瘤细胞IC50值的影响：通过计算IC50值，发现该新型抗肿瘤药物对A549、SGC-7901和MCF-7细胞的IC50值分别为46.2μM、35.8μM 和43.1μM。
五、讨论本研究通过体外细胞实验，探讨了新型抗肿瘤药物在三种肿瘤细胞中的抗肿瘤活性。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇篇1一、引言肿瘤细胞增殖实验是研究肿瘤发生、发展及其相关机制的重要手段。
随着科技的进步，体外检测肿瘤细胞增殖的方法逐渐成为研究热点。
本文将对体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法、应用及优缺点进行综述，为相关研究者提供参考。
二、实验方法1. 细胞培养细胞培养是体外检测肿瘤细胞增殖的基础。
研究者需根据实验需求选择合适的细胞系，并掌握细胞培养的基本技术，如细胞的复苏、传代、冻存等。
2. 实验试剂与仪器在进行肿瘤细胞增殖实验时，需要使用一系列的试剂和仪器，如细胞计数试剂、酶标仪、显微镜等。
这些试剂和仪器的选择对实验结果的准确性至关重要。
三、实验技术1. MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖的方法，其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT，生成蓝色结晶物并沉积在细胞中，从而反映细胞的增殖情况。
该方法具有操作简便、快速、准确等优点，在肿瘤细胞增殖实验中得到了广泛应用。
2. BrdU法BrdU法是通过检测细胞内BrdU的掺入量来反映细胞的增殖活性。
该方法需要预先在培养基中加入BrdU，然后通过特异性抗体检测BrdU的掺入量。
BrdU法具有较高的灵敏度和特异性，能够更准确地反映细胞的增殖情况。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种能够同时检测单个细胞多个参数的技术，可以用于分析细胞的周期、凋亡、增殖等情况。
在肿瘤细胞增殖实验中，流式细胞术可以用于检测细胞的DNA含量、BrdU掺入量等指标，从而更全面地了解细胞的增殖情况。
四、应用及优缺点1. 药物筛选与评价体外检测肿瘤细胞增殖实验可以用于药物的筛选与评价。
通过检测药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，可以评估药物的抗肿瘤活性，为药物的进一步研究和开发提供依据。
2. 肿瘤病理学研究体外检测肿瘤细胞增殖实验还可以用于肿瘤病理学研究。
通过分析肿瘤细胞的增殖特性，可以了解肿瘤的发生、发展及其相关机制，为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。
3. 个体化治疗与预后判断体外检测肿瘤细胞增殖实验在个体化治疗和预后判断中也具有重要价值。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告随着肿瘤研究的不断深入，传统的体内实验已经难以满足对肿瘤细胞增殖的准确检测，因此体外实验成为了肿瘤学研究的重要手段之一。
体外实验可以通过模拟人体内不同的环境来检测细胞在不同条件下的生长和增殖情况，以评估化合物或药物对细胞增殖的影响。
本文将从体外检测肿瘤细胞增殖的方法、优点及缺点、应用以及发展趋势等方面进行综述。
一、体外检测方法1. MTT法MTT法是一种较为简单、高通量的体外检测肿瘤细胞增殖的方法。
MTT试剂被还原为紫色的甲基溴化四唑，可通过分光光度计读取细胞数量和代谢活性，进而评估细胞增殖。
该方法适用于多种肿瘤细胞，包括淋巴瘤、乳腺癌、慢性髓性白血病等。
2. SRB法SRB法是一种将孵育细胞暴露于固定试剂（如三甲基硫醇盐）的体外细胞增殖测试方法。
三甲基硫醇盐会在细胞内与酸性物质结合，形成具有吸光度的紫色络合物。
该方法通常测量细胞种植密度、药物浓度和孵育时间等参数对细胞增殖的影响。
3. CFSE染色法CFSE染色法是一种流式细胞术，它使用一种绿色荧光素酰氯，可标记细胞的染色体。
当染色的细胞进入体内时，它们在短时间内通过复制遗传物质而散发出增加的荧光。
该方法适用于检测细胞核分裂、增殖速度和细胞寿命等方面的变化。
二、优点与缺点1. 优点（1）能评估化合物或药物对肿瘤细胞生长的影响，但不需进行动物实验。
（2）与体内实验相比，体外实验具有时间和成本优势。
（3）体外实验结果容易重复，从而提高结果的可靠性。
2. 缺点（1）不如体内实验直接评估药物治疗的效果。
（2）细胞生长环境和体内情况不同，在实验室条件下模拟体内情况会受到一些限制。
（3）细胞在体外环境下不可避免地发生异常。
三、应用体外实验在肿瘤学研究中被广泛应用，主要包括以下方面：1. 药物筛选体外实验可用于筛选具有抗肿瘤活性的化合物或药物，以确定哪些化合物或药物更有可能进入进一步的临床试验。
2. 分子机制研究体外实验可以通过检测肿瘤细胞的生长速率、形态和分化来验证分子机制假设。
体外细胞的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在研究体外细胞培养技术，通过观察细胞在不同条件下的生长、形态变化和生物学特性，探讨细胞培养方法在生物学研究中的应用。
二、实验材料与仪器1. 材料：- 人胚胎肾细胞（HEK293细胞）- DMEM培养基- 胎牛血清（FBS）- 0.25%胰蛋白酶- 10%胎牛血清- 无菌培养皿- 移液器- 吸管- 显微镜- 紫外可见分光光度计2. 仪器：- 培养箱- 恒温培养箱- CO2培养箱三、实验方法1. 细胞培养：- 将HEK293细胞接种于无菌培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
- 每2-3天更换一次培养基。
2. 细胞传代：- 当细胞生长至80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞。
- 将收集到的细胞用DMEM培养基稀释至所需浓度，接种于新的培养皿中。
3. 细胞形态观察：- 使用显微镜观察细胞在不同培养时间下的形态变化。
- 拍照记录细胞形态。
4. 细胞活力检测：- 使用MTT法检测细胞活力。
- 将细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入MTT溶液，继续培养4小时。
- 使用酶标仪检测吸光度值。
5. 细胞增殖实验：- 将细胞接种于培养皿中，培养不同时间后，收集细胞，进行细胞计数。
- 计算细胞增殖率。
四、实验结果1. 细胞形态观察：- 初始接种的细胞呈梭形，细胞间连接紧密。
- 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞间连接变稀疏，部分细胞出现变圆、萎缩等现象。
2. 细胞活力检测：- 细胞活力随培养时间的延长而降低。
3. 细胞增殖实验：- 细胞增殖率随培养时间的延长而降低。
五、实验讨论本实验成功培养了HEK293细胞，并通过观察细胞形态、细胞活力和细胞增殖实验，初步了解了细胞在不同条件下的生物学特性。
细胞培养技术在生物学研究中具有重要意义，可以用于研究细胞生物学、分子生物学、药理学等领域。
六、实验结论1. 体外细胞培养技术可以成功培养HEK293细胞。
2. 细胞在不同培养条件下表现出不同的生物学特性。
体外细胞刺激实验报告
一、实验背景随着现代生物技术的快速发展，体外细胞刺激实验在生物学研究、药物筛选、疾病诊断和治疗等领域发挥着越来越重要的作用。
本实验旨在探讨不同刺激条件下细胞生物学行为的改变，为相关研究提供实验依据。
二、实验目的1. 观察不同刺激条件下细胞形态、生长和增殖的变化；2. 分析细胞在刺激条件下的基因表达和信号转导变化；3. 为后续相关研究提供实验参考。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞：人胚肾细胞系HEK293；- 刺激物：表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、佛波酯（PMA）；- 药品与试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、抗细胞周期蛋白抗体、抗磷酸化细胞周期蛋白抗体、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、细胞计数试剂盒、流式细胞仪等。
2. 实验仪器：- 倒置显微镜；- 酶标仪；- 实时荧光定量PCR仪；- 流式细胞仪。
四、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，置于细胞培养箱中培养至对数生长期。
2. 刺激处理：将细胞分为对照组、EGF组、TNF-α组和PMA组，分别加入相应浓度的刺激物处理细胞。
3. 观察细胞形态：使用倒置显微镜观察细胞形态变化。
4. 细胞计数：使用细胞计数试剂盒检测细胞生长和增殖情况。
5. 细胞周期分析：使用流式细胞仪检测细胞周期分布。
6. 基因表达分析：- RNA提取：使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；- 逆转录：使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；- 实时荧光定量PCR：使用实时荧光定量PCR试剂盒检测目的基因的表达水平。
五、实验结果1. 细胞形态：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞形态发生明显变化，细胞变得扁平，部分细胞出现突起。
2. 细胞计数：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞数量明显增加，细胞增殖加快。
3. 细胞周期分析：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞周期分布发生改变，S期细胞比例增加。
小鼠的体外实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外培养小鼠细胞，观察细胞在不同条件下的生长情况，分析细胞增殖、分化及凋亡等相关生物学行为，为进一步研究小鼠细胞生物学特性提供实验依据。
二、实验材料1. 小鼠胚胎成纤维细胞（CRL-1658）；2. DMEM培养基（高糖）；3. 胎牛血清；4. 0.25%胰蛋白酶；5. PBS缓冲液；6. CO2培养箱；7. 倒置显微镜；8. 流式细胞仪；9. 试剂盒及相关仪器。
三、实验方法1. 细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于6孔板，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于CO2培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。
2. 细胞传代：当细胞贴壁生长至约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1:3比例传代。
3. 实验分组：将细胞分为实验组和对照组，实验组给予不同浓度的实验药物处理，对照组给予等体积的溶剂处理。
4. 细胞形态观察：利用倒置显微镜观察细胞在不同处理条件下的形态变化。
5. 细胞增殖检测：采用CCK-8法检测细胞增殖情况，每组设3个复孔。
6. 细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况，每组设3个复孔。
7. 细胞周期分析：采用PI染色法检测细胞周期分布，每组设3个复孔。
8. 流式细胞仪检测：对细胞进行流式细胞仪检测，分析细胞增殖、凋亡及周期分布情况。
四、实验结果1. 细胞形态观察：实验组细胞在给予不同浓度实验药物处理后，细胞形态发生明显变化，与对照组相比，细胞生长速度减慢，细胞皱缩、变圆，部分细胞出现凋亡现象。
2. 细胞增殖检测：CCK-8法结果显示，实验组细胞增殖明显低于对照组，且随着实验药物浓度增加，细胞增殖抑制作用增强。
3. 细胞凋亡检测：Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，实验组细胞凋亡率明显高于对照组，且随着实验药物浓度增加，细胞凋亡率升高。
4. 细胞周期分析：PI染色法结果显示，实验组细胞周期分布发生改变，S期细胞比例降低，G2/M 期细胞比例升高，说明实验药物处理可抑制细胞增殖，促进细胞周期阻滞。
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细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。
从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。
#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。
UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。
抗uchl3抗体购自ProteinTech公司
(12384 - 1 - ap)。
抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。
反
γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)
从微孔被购买。
Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和
anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。
抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。
Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体
购买的σ。
反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。
CRISPR / Cas9敲除
(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT
CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC
ACCTCGG-3′)。
gRNA序列被克隆到载体中。
LentiCRISPR-V2-puro。
细胞被慢病毒感染
sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。
通过免疫印迹鉴定克隆
抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。
重组蛋白表达和下拉试验。
构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列
被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。
为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。
总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。
然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。
细胞
然后用超声波提取和裂解。
细胞溶解产物
用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化
分别是GST和GST- uchl3蛋白。
体外GST-UCHL3拉试验,50µg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50µg His-UCHL3额外2 h在4°C。
然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。
结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。
用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3
体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验
对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5
毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1毫米碘乙酰胺;煮15分钟;用含有蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液、20mm NEM和1mm碘乙酰胺进行测定10次;然后离心分离细胞碎片。
细胞提取物的免疫沉淀与指示抗体和涂抹抗ub抗体。
为了制备大量泛素化蛋白作
为体外脱泛素实验的底物，HEK293T细胞与Myc-RAD51和His-Ubexpression载体一起转染。
在变性条件下，用他的珠子从细胞提取物中纯化泛素蛋白。
接下来，用Ub-RAD51蛋白从细胞提取物中纯化抗myc -琼脂糖颗粒在裂解缓冲液(50mm Tris-HCl pH)中7.8, 137毫米NaCl, 10毫米NaF, 1毫米EDTA, 1% Triton X-1000.2%萨科齐，1mm DTT, 10%甘油，新鲜蛋白酶抑制剂)。
重组GST-UCHL3和UCHL3 CA在BL21细胞中表达，按照标准方案纯化。
deubiquitination测定体外,ubiquitinated蛋白质是孵化与重组UCHL3 eubiquitination 缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,50 mM氯化钠,EDTA 1毫米,10毫米德勤,5%甘油)4 h
30°C。
芯片
通过转染I-SceI表达质粒，在U2OS DR-GFP细胞中诱导单个DSB。
转染后24小时，细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟，将蛋白质与DNA交联。
加入甘氨酸(0.125 M) 5分钟，停止交联。
细胞被收获,颗粒在细胞裂解缓冲resuspended(5毫米管道(KOH)在pH值8.0,85毫米
氯化钾,0.5% NP-40)亮抑酶肽1μg /毫升,1μg /毫升抑肽酶,1
毫米PMSF。
核在2000克的离心作用下，5分钟内被离心分离，然后在核溶解缓冲中重新悬浮（50 mM Tris在pH.1，10毫米EDTA，1%SDS，1 g/mL，1 g/mL aprotinin，1毫米PMSF），并将染色质切成平均大小为0.6 kb的染色质。
用三文鱼精子DNA/蛋白-琼脂糖浆液预先清除裂解物。
每个上清液的10%作为输入控制，并通过交联反转步骤进行处理。
其余的上层清
液与5μg孵化表示抗体在一夜之间在4°C。
珠被洗了四次:一次在高盐缓冲(50毫米Tris-HCl
pH值8.0,500毫米氯化钠,0.1% SDS、脱氧胆酸盐0.5%,1% NP-40,1毫米EDTA),在氯化锂缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,250毫米氯化锂,NP-40 1%,0.5%脱氧胆酸盐,1毫米EDTA),和两次TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA,pH值8.0)。
然后在洗脱缓冲液(1% SDS, 0.1 M NaHCO3)中重新悬浮，在室温下旋转20分钟。
洗脱样品孵育0.2 M
氯化钠一夜之间在65°C到反向交联。
样本
孵化与核糖核酸酶为30分钟37°C其次是蛋白酶K 1 h在37°C。
然后使用PCR清理试剂盒对DNA进行纯化，并用于定量PCR分析。
芯片的PCR引物,∼220个碱基对远离I-SceI削减网站如下:向前,5′-GAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3′;和反向5′-CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC-3′。
HR分析
我们使用来自Maria Jasin博士(纪念斯隆凯特琳癌症中心)的U2OS DR-GFP细胞，通过CRISPR系统产生控制或UCHL3敲除U2OS DR-GFP细胞系。
将ISceI表达载体(pCBA-I-SceI)转染到细胞中。
在I-SceI转染后2 d采集细胞，并使用流式细胞术检测I-SceI消化诱导的重组。
采用pEGFP-C1平行转染法对转染效率进行归一化处理。
统计数据
对于细胞存活试验和HR试验，数据提出了均值±SEM的三个独立的实验。
对于焦点形成分析，提出了数据作为三个独立的均值±SEM。
每项实验计数超过200个细胞。
统计分析采用t检验、方差分析或log-rank检验。
图中有1个星号表示P < 0.05, 2个星号表示P < 0.01。
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