现代微生物遗传学第三章质粒详解演示文稿
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现代微生物遗传学-第三单元授课-课件
在DNA复制过程中，由 于DNA聚合酶的错误， 导致碱基对的增添、缺
失或替换。
化学诱变
物理诱变
生物诱变
某些化学物质可以引起 碱基对的替换，导致基
因突变。
某些物理因素如紫外线、 X射线等可以引起基因突
变。
某些病毒或细菌可以引 起基因突变。
基因重组过程
01
02
03
同源重组
指两个同源DNA分子之间 的重组，涉及到DNA的断 裂、交换和修复。
基因突变
基因突变产生遗传变异，为微生物提供进化基础。
3
基因重组
微生物通过基Βιβλιοθήκη 重组，交换遗传物质，加速进化 过程。
系统发育分析方法
分子生物学方法
01
利用分子生物学技术，如DNA测序和基因组学分析，研究微生
物的系统发育关系。
形态学特征
02
通过比较微生物的形态学特征，如细胞形态、染色特性等，进
行系统发育分析。
级联调节
通过一系列的级联反应，使基因 表达得到精细调控。
基因表达调控应用
疾病治疗
通过调控特定基因的表达，治疗遗传性疾病和癌 症等疾病。
生物工程
通过调控微生物的基因表达，改良微生物生产性 能，生产药物和生物燃料等。
生物进化研究
通过研究基因表达的调控机制，揭示生物进化的 奥秘。
04
微生物进化与系统发育
生物地理学方法
03
利用生物地理学方法，研究微生物在全球范围内的分布和演化
历程。
系统发育研究意义
揭示生命起源与演化
系统发育研究有助于揭示生命起源与演化的历程，理解生物多样 性的形成机制。
疾病防控与治疗
通过系统发育分析，有助于发现病原微生物的演化规律，为疾病 防控和治疗提供科学依据。
失或替换。
化学诱变
物理诱变
生物诱变
某些化学物质可以引起 碱基对的替换，导致基
因突变。
某些物理因素如紫外线、 X射线等可以引起基因突
变。
某些病毒或细菌可以引 起基因突变。
基因重组过程
01
02
03
同源重组
指两个同源DNA分子之间 的重组，涉及到DNA的断 裂、交换和修复。
基因突变
基因突变产生遗传变异，为微生物提供进化基础。
3
基因重组
微生物通过基Βιβλιοθήκη 重组，交换遗传物质，加速进化 过程。
系统发育分析方法
分子生物学方法
01
利用分子生物学技术，如DNA测序和基因组学分析，研究微生
物的系统发育关系。
形态学特征
02
通过比较微生物的形态学特征，如细胞形态、染色特性等，进
行系统发育分析。
级联调节
通过一系列的级联反应，使基因 表达得到精细调控。
基因表达调控应用
疾病治疗
通过调控特定基因的表达，治疗遗传性疾病和癌 症等疾病。
生物工程
通过调控微生物的基因表达，改良微生物生产性 能，生产药物和生物燃料等。
生物进化研究
通过研究基因表达的调控机制，揭示生物进化的 奥秘。
04
微生物进化与系统发育
生物地理学方法
03
利用生物地理学方法，研究微生物在全球范围内的分布和演化
历程。
系统发育研究意义
揭示生命起源与演化
系统发育研究有助于揭示生命起源与演化的历程，理解生物多样 性的形成机制。
疾病防控与治疗
通过系统发育分析，有助于发现病原微生物的演化规律，为疾病 防控和治疗提供科学依据。
三质粒与载体ppt课件
Transcription beyond oriV Hybridisation at/near oriV
-445 - 555
RNAaseH cleaves at oriV 2/3 bp accuracy
-445
ONLY 580 bps needed and ONLY 13 after oriV
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
分子量小的(如ColE1质粒)拷贝数高，每个细胞中有10～100个 拷贝的质粒，说明它们的复制不受到严格控制，称为松弛型 质粒(relaxed plasmids)或高拷贝质粒。基因工程中为获得大 量的基因产物所用的载体质粒便是这类松弛型质粒。
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（ P202）
质粒的主要类型
质粒所编码 的功能和赋 予宿主的表 型效应
致育因子(Fertility factor，F因子) 抗性因子(Resistance factor，R因子) 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒(virulence plasmid) 代谢质粒(Metabolic plasmid) 隐秘质粒(cryptic plasmid)
质粒编码的两个负调控因子Rop蛋白质和反义RNA (RNAⅠ) ，控制了DNA复制过程中所必需的引物 的合成。
在ColE1复制原点上游方向445 bp处(相当于RNAⅡ 的第111个碱基的位置)处起始转录另一个RNA分子， 其转录方向与RNAⅡ相反，它是由双链DNA链上的 另一条链(C-链)为模板进行转录的，这个RNA分子称 为RNA I，属于反义RNA。
《质粒和噬菌体》课件
根据质粒的复制子可分为滚环复制型质粒和复制环复制型质粒。
根据质粒的用途可分为抗生素抗性基因质粒、代谢缺陷型质粒、温度敏感型质粒等 。
02
质粒的复制和传播
质粒的复制
自主复制
质粒能够独立于宿主染色体进行复制，并保持稳定的遗传特性。
复制起点
质粒复制起始于特定的DNA序列，称为复制起点或Ori。
复制酶
质粒复制需要特定的复制酶，这些酶能够识别并催化Ori序列，启动DNA复制。
自我复制
噬菌体在宿主细胞内复制 增殖，最终导致宿主细胞 裂解，释放出子代噬菌体 。
无独立生活能力
噬菌体没有独立的代谢和 能量转化能力，只能在宿 主细胞内才能进行正常的 生命活动。
噬菌体的种类
根据基因组的不同，噬菌体可以分为 DNA噬菌体和RNA噬菌体两大类。
根据形态的不同，噬菌体可以分为蝌 蚪形、微球形、丝形、棒形等不同类 型。
生物信息学研究
质粒和噬菌体的基因序列 可用于生物信息学分析， 研究基因组学、进化关系 等生物学问题。
THANKS
感谢观看
质粒复制和传播的机制
复制与传播的关联
质粒复制和传播机制密切相关， 复制酶在复制过程中也参与质粒
的传播。
接合作用
在转化过程中，质粒DNA通过细 菌的膜通道进入受体细胞，与受体 细胞染色体整合或独立复制。
重组与整合
在转导过程中，质粒DNA与噬菌体 DNA发生重组，通过噬菌体的感染 和整合酶的作用，将质粒DNA整合 到受体细胞染色体中。
04
噬菌体的复制和生命周期
噬菌体的复制周期
侵入
噬菌体通过融合、出芽或注入 等方式将遗传物质注入宿主细 胞内。
组装
新的噬菌体DNA与蛋白质外壳 结合，形成完整的噬菌体粒子 。
根据质粒的用途可分为抗生素抗性基因质粒、代谢缺陷型质粒、温度敏感型质粒等 。
02
质粒的复制和传播
质粒的复制
自主复制
质粒能够独立于宿主染色体进行复制，并保持稳定的遗传特性。
复制起点
质粒复制起始于特定的DNA序列，称为复制起点或Ori。
复制酶
质粒复制需要特定的复制酶，这些酶能够识别并催化Ori序列，启动DNA复制。
自我复制
噬菌体在宿主细胞内复制 增殖，最终导致宿主细胞 裂解，释放出子代噬菌体 。
无独立生活能力
噬菌体没有独立的代谢和 能量转化能力，只能在宿 主细胞内才能进行正常的 生命活动。
噬菌体的种类
根据基因组的不同，噬菌体可以分为 DNA噬菌体和RNA噬菌体两大类。
根据形态的不同，噬菌体可以分为蝌 蚪形、微球形、丝形、棒形等不同类 型。
生物信息学研究
质粒和噬菌体的基因序列 可用于生物信息学分析， 研究基因组学、进化关系 等生物学问题。
THANKS
感谢观看
质粒复制和传播的机制
复制与传播的关联
质粒复制和传播机制密切相关， 复制酶在复制过程中也参与质粒
的传播。
接合作用
在转化过程中，质粒DNA通过细 菌的膜通道进入受体细胞，与受体 细胞染色体整合或独立复制。
重组与整合
在转导过程中，质粒DNA与噬菌体 DNA发生重组，通过噬菌体的感染 和整合酶的作用，将质粒DNA整合 到受体细胞染色体中。
04
噬菌体的复制和生命周期
噬菌体的复制周期
侵入
噬菌体通过融合、出芽或注入 等方式将遗传物质注入宿主细 胞内。
组装
新的噬菌体DNA与蛋白质外壳 结合，形成完整的噬菌体粒子 。
质粒种类与应用-PPT精品文档139页
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
克隆载体
基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段 DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目 的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等
基因工程载体的构建必需应用表达调控 的基本理论知识，应用已知的调控序列进行 重组、改造。
基因载体应具备的条件：
Cop
Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
E c o R I S a c I K p n I S m a I B a m H I X b a I S a lI P stI S p h I H in d I II
pU C 19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
三个显著特点：
（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更 高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利 用-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构 成。
微生物遗传学 第三章PPT课件
❖ 功能等位性： 对于基因等位性的判断不来自基因位置的测定，而 来自基因功能的测定，这种等位性称为功能等位性。
❖ 互补测验的基本要求： 1. 能使2个突变型的基因同处1个细胞，形成二倍体
获局部合子。 2. 同处1个细胞的2个突变型的基因不可以重组。
可用于互补测验的系统
1. 沙门氏菌的流产转导 2. HFT中的杂基因子： gal - / dgal – 3. F’ 转导： lac - / F-lac 4. 异核体 5. 噬菌体的共感染
形成机制证明
二、T4噬菌体的基因重组
S.Benzer 对T4噬菌体的rIIA和 rIIB2个基因进行了 结构分析，证明1个基因内有大量的突变子和重组 子。遗传重组可以发生在基因内部。
S.Benzer实验：
E.Coli B
Wild type T4 +
T4rII
+
E.coli K + -
❖ S.Benzer 巧妙的利用野生型和突变型T4对 寄主的要求不同，设计了实验：
❖ 所有的反转录病毒RNA基因组和mRNA都具有相同 的5’端。在5’端形成cap结构:m7GpppGmp 。
❖ 初级转录本在3’端的R序列中含有加尾信号： AAUAAA,在3’端生成poly(A) 尾巴。
❖ 加工后的RNA转移到细胞质中，一些作为基因组 RNA，一些作为mRNA，翻译产生病毒所需的蛋白 质。
可以持续的表达。 ❖ LTR不但提供了整合所需的末端序列，而且也提供
了转录及转录后加工的信号。 ❖ 图3－30 ❖ 由原病毒DNA转录的RNA既可以作为mRNA进一步
合成病毒的蛋白质，也可以作为子代病毒的RNA基 因组。
2 转录后加工
❖ 反转录病毒RNA基因组以及大多数病毒mRNA并非 一次合成的，而是经由1个初级转录本加工而成。
❖ 互补测验的基本要求： 1. 能使2个突变型的基因同处1个细胞，形成二倍体
获局部合子。 2. 同处1个细胞的2个突变型的基因不可以重组。
可用于互补测验的系统
1. 沙门氏菌的流产转导 2. HFT中的杂基因子： gal - / dgal – 3. F’ 转导： lac - / F-lac 4. 异核体 5. 噬菌体的共感染
形成机制证明
二、T4噬菌体的基因重组
S.Benzer 对T4噬菌体的rIIA和 rIIB2个基因进行了 结构分析，证明1个基因内有大量的突变子和重组 子。遗传重组可以发生在基因内部。
S.Benzer实验：
E.Coli B
Wild type T4 +
T4rII
+
E.coli K + -
❖ S.Benzer 巧妙的利用野生型和突变型T4对 寄主的要求不同，设计了实验：
❖ 所有的反转录病毒RNA基因组和mRNA都具有相同 的5’端。在5’端形成cap结构:m7GpppGmp 。
❖ 初级转录本在3’端的R序列中含有加尾信号： AAUAAA,在3’端生成poly(A) 尾巴。
❖ 加工后的RNA转移到细胞质中，一些作为基因组 RNA，一些作为mRNA，翻译产生病毒所需的蛋白 质。
可以持续的表达。 ❖ LTR不但提供了整合所需的末端序列，而且也提供
了转录及转录后加工的信号。 ❖ 图3－30 ❖ 由原病毒DNA转录的RNA既可以作为mRNA进一步
合成病毒的蛋白质，也可以作为子代病毒的RNA基 因组。
2 转录后加工
❖ 反转录病毒RNA基因组以及大多数病毒mRNA并非 一次合成的，而是经由1个初级转录本加工而成。
优选现代微生物遗传学第三章质粒
中被淘汰
– 选择性抑制带有质粒的菌的生长。
– 2.原生质体消除法
• 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体， 在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。
• 二、遗传转移
– 将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较 导入前后表型性状的差异或恢复程度。
• 三、分子杂交
– 在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已 知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检 测其菌株是否含有该种质粒。
第二节 质粒编码的遗传表型
• 大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状， 具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以 下几类： – 1.致育质粒 – 2.抗药性质粒 • 组成：转移区和抗性决定子 • 抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生 素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细 胞中被抗生素作用的靶点。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称 为oriV,大肠杆菌为 oriC。
• 复制主要通过型复
制和滚环复制之一
进行。其中以型复
制为主（包括单向 和双向）。
• 质粒只编码一种或 少数几种与复制有 关的蛋白质，其他 复制蛋白都来自宿 主。
– 2.复制起点区oriV的 功能和pBR322质粒 • 复制起点区oriV 功能与质粒载体 的构建、寄主范 围
– 3.产生抗生素的质粒
• 细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同 亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。
• Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。 – 4.产生毒性的质粒(BT) – 5.降解质粒：
• 假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长 的细菌。其体内含有大量的降解质粒。
– 选择性抑制带有质粒的菌的生长。
– 2.原生质体消除法
• 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体， 在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。
• 二、遗传转移
– 将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较 导入前后表型性状的差异或恢复程度。
• 三、分子杂交
– 在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已 知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检 测其菌株是否含有该种质粒。
第二节 质粒编码的遗传表型
• 大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状， 具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以 下几类： – 1.致育质粒 – 2.抗药性质粒 • 组成：转移区和抗性决定子 • 抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生 素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细 胞中被抗生素作用的靶点。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称 为oriV,大肠杆菌为 oriC。
• 复制主要通过型复
制和滚环复制之一
进行。其中以型复
制为主（包括单向 和双向）。
• 质粒只编码一种或 少数几种与复制有 关的蛋白质，其他 复制蛋白都来自宿 主。
– 2.复制起点区oriV的 功能和pBR322质粒 • 复制起点区oriV 功能与质粒载体 的构建、寄主范 围
– 3.产生抗生素的质粒
• 细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同 亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。
• Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。 – 4.产生毒性的质粒(BT) – 5.降解质粒：
• 假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长 的细菌。其体内含有大量的降解质粒。
现代微生物遗传学-第三章质粒课件
质粒在生物能源开发中的应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
质粒在生物能源开发中具有重要作用，可以用于构建高效 生物燃料生产菌株。
质粒可以携带与生物燃料生产相关的基因，将其转移至微 生物中，从而构建出能够高效生产生物燃料的菌株。例如 ，可以利用质粒将油脂合成酶基因转移至酵母菌中，构建 出能够高效生产生物柴油的菌株。此外，质粒还可以用于 提高微生物对光能的利用率，从而构建出能够高效生产太 阳能的微生物。因此，质粒在生物能源开发中具有重要作 用。
详细描述
20世纪60年代，科学家们开始对质粒进行更深入的研究，探索其复制机制和遗传特性。他们发现质粒可以在细菌 细胞内独立于染色体复制，并且可以在不同细菌之间转移和遗传。这些发现为后来的基因工程和分子生物学研究 奠定了基础。
质粒的遗传学研究
总结词
质粒的遗传学研究涉及到多个方面，包括质粒的复制、转录、表达以及质粒与宿主细胞 的相互关系等。
代谢能力
质粒携带的基因可以影响细菌的 代谢能力，帮助细菌在特定环境 下生存和繁殖。
质粒与细菌的进化
基因水平转移
质粒是细菌间基因水平转移的主要载体，有 助于细菌获得新的遗传物质和进化。
协同进化
质粒上的基因与其他细菌基因协同进化，形成复杂 的基因网络，影响细菌的进化方向。
适应性进化
质粒携带的基因可以促进细菌的适应性进化 ，使其更好地适应不断变化的环境。
终止子的作用
终止子是一个特殊的DNA序列，它能够终止复制子的复 制，确保质粒的复制不会无限进行下去。
质粒的复制
复制的起始
复制的调控
质粒的复制起始于复制起始位点，该 位点通常是一个特定的DNA序列，能 够被质粒编码的复制蛋白识别并与之 结合。
质粒载体的概况及构建PPT课件
典型的质粒克隆技术：
① 用限制性内切酶消化DNA样品 ② 用限制性内切酶消化质粒DNA ③ 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物 ④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 ⑤ 涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选
④ 用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞时转化细菌 有两个基本方法：
一是化学法，即用CaCl₂处理并加热激以促进DNA进入 菌体；
You Know, The More Powerful You Will Be
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
★ 质粒不是细菌生长所必须的 ★ 可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力 ★ 分子量在1~200kb之间
质粒（plasmid）
特点： 能在宿主细胞内独立复制；带有某些遗传信息，会赋予
宿主细胞一些遗传性状。
（二）质粒的基本特性
(1) 自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori） 控制质粒拷贝数的基因 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制
质粒载体的概况及制备
质粒载体的概况
1 质粒的定义、命名 2 质粒的基本特性 3 质粒的分类
质粒的定义、命名（：一） 质粒的定义、命名
• 定义：质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能 自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
• 命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发明者，后 面接实验编号。
二是电激法，即施加短脉冲的电荷以促进DNA吸收。
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– 6.致病性质粒： • 根癌土壤农杆菌的Ti质粒；以及破伤风梭菌、肉毒 梭菌和大肠杆菌等都存在致病性质粒。
– 7. 共生固氮质粒 • 根瘤菌普遍喊有该类质粒。
• 包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作 用可有正或负的调节作用。
– 8. 隐蔽质粒(cryptic plasmid) • 酵母的2m质粒（p171） – 长为2m的6kb的环状双链DNA分子 – 位于酵母细胞核内，50~100拷贝 – 只携带与复制和重组有关的4 个基因，无遗传表 型
– 3.产生抗生素的质粒
• 细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同 亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。
• Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。 – 4.产生毒性的质粒(BT) – 5.降解质粒：
• 假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长 的细菌。其体内含有大量的降解质粒。
现代微生物遗传学第三章质粒详解演 示文稿
优选现代微生物遗传学第三章质粒
• 一、质粒的发现
– F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒
– 20世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他 质粒的发现
– 20世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子 生物学研究中。
• 二、质粒的命名原则
– 最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行 命名。(F因子、R质粒、Col质粒等)
– 纯化和检测方法 • 琼脂糖凝胶电泳(质粒3种构型泳动速度不同，琼 脂糖浓度，EB染色，分子量的判断) • 氯化铯-EB密度梯度离心 • 电镜观察
第四节 质粒的复制与调节
• 一、质粒的大小和拷贝数 – 1.大小测定 • 表示方式：MD或kb，1MD的双链DNA≈1.65kb。 • 测定方法：电泳、电镜、测序。 • 大小范围：1~200kb，个别800~1000。 – 2.质粒的拷贝数 • 严紧型质粒(stringent plasmid)或低拷贝质粒； • 松弛型质粒(relaxed plasmid)或高拷贝质粒。（氯霉 素可抑制细胞分离，终止染色体复制，但松弛型质 粒可持续复制，其拷贝数可达到1000~3000）。
• 四、质粒的分离、检测与纯化
– 质粒分离方法：碱变性法
• 菌体的培养和收集
• 溶菌
• 碱变性处理
• 离心分离
• 有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性 后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性， 这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构， 而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过 离心，这样可以缩短提取质粒的时间。
三、质粒复制的调控
• 质粒的调控一般采用直接或间接的负调控机制。 • 负调控因子可是蛋白质、RNA或DNA重复序列。 • 调控类型可分两类：
– 抑制物-靶位调控(inhibitor-target regulation) – 重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation)
• 1.抑制物-靶位调控
• 依赖一小段反向转录的 RNA作为抑制物，通过它 与质粒DNA复制引物或编 码Rep蛋白（复制蛋白） 的mRNA的互补结合以阻 止质粒复制的起始。
– (1) ColE1质粒复制调控 （P122图5-7）
– 质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和 一个2.3kb小区域所间隔
– 两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重 组，可使质粒互变异构成A型和B型。
第三节 质粒的检测
• 检测质粒的方法主要根据质粒的（遗传学特性）和 （分子结构特性）。 – 遗传特性：独特的表型、转移、人为消除等。 – 分子结构：cccDNA和染色体相比对理化因子有更 强的抗性。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称 为oriV,大肠杆菌为 oriC。
• 复制主要通过型复
制和滚环复制之一
进行。其中以型复
制为主（包括单向 和双向）。
• 质粒只编码一种或 少数几种与复制有 关的蛋白质，其他 复制蛋白都来自宿 主。
– 2.复制起点区oriV的 功能和pBR322质粒 • 复制起点区oriV 功能与质粒载体 的构建、寄主范 围
第二节 质粒编码的遗传表型
• 大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状， 具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以 下几类： – 1.致育质粒 – 2.抗药性质粒 • 组成：转移区和抗性决定子 • 抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生 素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细 胞中被抗生素作用的靶点。
• 一、质粒消除（理化因子和生物学方法） – 理化因子消除法 • 消除剂：吖啶类，EB，某些抗生素，高温，UV等 • 如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还 是染色体基因突变的结果呢？
– 回复突变情况 – 突变率 • 理化因子消除质粒的作用机制： – 对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长
中被淘汰
– 选择性抑制带有质粒的菌的生长。
– 2.原生质体消除法
• 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体， 在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。
• 二、遗传转移
– 将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较 导入前后表型性状的差异或恢复程度。
• 三、分子杂交
– 在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已 知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检 测其菌株是否含有该种质粒。
– 1976年Novick提出了质粒命名原则： • 质粒名称一般由三个英文字母及编号组成； • 第一个字母一律小写p表示（plasmid）
• 后两他特征的英文缩写。
• 编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的不同质粒。 (pUC18, pUC19等)
• pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白对质粒的复
制负调控）区；pSC101的tetr；Tn3的ampr。属中等拷 贝质粒，10~30个/细胞 • pUC类：高拷贝质粒（100~300个/细胞），也是pMB1
的ori，但是没有rop。
• 质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定
于质粒的ori区域。
– 7. 共生固氮质粒 • 根瘤菌普遍喊有该类质粒。
• 包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作 用可有正或负的调节作用。
– 8. 隐蔽质粒(cryptic plasmid) • 酵母的2m质粒（p171） – 长为2m的6kb的环状双链DNA分子 – 位于酵母细胞核内，50~100拷贝 – 只携带与复制和重组有关的4 个基因，无遗传表 型
– 3.产生抗生素的质粒
• 细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同 亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。
• Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。 – 4.产生毒性的质粒(BT) – 5.降解质粒：
• 假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长 的细菌。其体内含有大量的降解质粒。
现代微生物遗传学第三章质粒详解演 示文稿
优选现代微生物遗传学第三章质粒
• 一、质粒的发现
– F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒
– 20世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他 质粒的发现
– 20世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子 生物学研究中。
• 二、质粒的命名原则
– 最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行 命名。(F因子、R质粒、Col质粒等)
– 纯化和检测方法 • 琼脂糖凝胶电泳(质粒3种构型泳动速度不同，琼 脂糖浓度，EB染色，分子量的判断) • 氯化铯-EB密度梯度离心 • 电镜观察
第四节 质粒的复制与调节
• 一、质粒的大小和拷贝数 – 1.大小测定 • 表示方式：MD或kb，1MD的双链DNA≈1.65kb。 • 测定方法：电泳、电镜、测序。 • 大小范围：1~200kb，个别800~1000。 – 2.质粒的拷贝数 • 严紧型质粒(stringent plasmid)或低拷贝质粒； • 松弛型质粒(relaxed plasmid)或高拷贝质粒。（氯霉 素可抑制细胞分离，终止染色体复制，但松弛型质 粒可持续复制，其拷贝数可达到1000~3000）。
• 四、质粒的分离、检测与纯化
– 质粒分离方法：碱变性法
• 菌体的培养和收集
• 溶菌
• 碱变性处理
• 离心分离
• 有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性 后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性， 这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构， 而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过 离心，这样可以缩短提取质粒的时间。
三、质粒复制的调控
• 质粒的调控一般采用直接或间接的负调控机制。 • 负调控因子可是蛋白质、RNA或DNA重复序列。 • 调控类型可分两类：
– 抑制物-靶位调控(inhibitor-target regulation) – 重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation)
• 1.抑制物-靶位调控
• 依赖一小段反向转录的 RNA作为抑制物，通过它 与质粒DNA复制引物或编 码Rep蛋白（复制蛋白） 的mRNA的互补结合以阻 止质粒复制的起始。
– (1) ColE1质粒复制调控 （P122图5-7）
– 质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和 一个2.3kb小区域所间隔
– 两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重 组，可使质粒互变异构成A型和B型。
第三节 质粒的检测
• 检测质粒的方法主要根据质粒的（遗传学特性）和 （分子结构特性）。 – 遗传特性：独特的表型、转移、人为消除等。 – 分子结构：cccDNA和染色体相比对理化因子有更 强的抗性。
• 二、质粒的复制
– 1.质粒复制的方式(P120)
• 质粒的复制起点称 为oriV,大肠杆菌为 oriC。
• 复制主要通过型复
制和滚环复制之一
进行。其中以型复
制为主（包括单向 和双向）。
• 质粒只编码一种或 少数几种与复制有 关的蛋白质，其他 复制蛋白都来自宿 主。
– 2.复制起点区oriV的 功能和pBR322质粒 • 复制起点区oriV 功能与质粒载体 的构建、寄主范 围
第二节 质粒编码的遗传表型
• 大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状， 具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以 下几类： – 1.致育质粒 – 2.抗药性质粒 • 组成：转移区和抗性决定子 • 抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生 素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细 胞中被抗生素作用的靶点。
• 一、质粒消除（理化因子和生物学方法） – 理化因子消除法 • 消除剂：吖啶类，EB，某些抗生素，高温，UV等 • 如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还 是染色体基因突变的结果呢？
– 回复突变情况 – 突变率 • 理化因子消除质粒的作用机制： – 对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长
中被淘汰
– 选择性抑制带有质粒的菌的生长。
– 2.原生质体消除法
• 使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体， 在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。
• 二、遗传转移
– 将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较 导入前后表型性状的差异或恢复程度。
• 三、分子杂交
– 在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已 知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检 测其菌株是否含有该种质粒。
– 1976年Novick提出了质粒命名原则： • 质粒名称一般由三个英文字母及编号组成； • 第一个字母一律小写p表示（plasmid）
• 后两他特征的英文缩写。
• 编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的不同质粒。 (pUC18, pUC19等)
• pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白对质粒的复
制负调控）区；pSC101的tetr；Tn3的ampr。属中等拷 贝质粒，10~30个/细胞 • pUC类：高拷贝质粒（100~300个/细胞），也是pMB1
的ori，但是没有rop。
• 质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定
于质粒的ori区域。