中药代谢组学研究中生物样品前处理方法

中药代谢组学研究中生物样品前处理方

法

（作者：_________ 单位：___________ 邮编：___________ ）

作者：邹忠杰，梁生旺，袁经权，龚梦鹃

【摘要】总结中药代谢组学研究中生物样品（尿液、血液）的前处理

方法，主要包括：尿液中加入缓冲液提供相同的pH值和离子强度，

保持代谢物化学位移的恒定。利用有机溶剂沉淀法除去血液中的大分子物质，增加色谱柱的性能和使用寿命。血液和尿液样品在进行GC'MS分析前要进行衍生化处理。同时，对尿液和血液的采集与储存方法进行了总结。

【关键词】中药；代谢组学;样品前处理

Abstract: In order to reduce the chemical shift

variati on ,the pH and the con siste ncy of io nic stre ngth were

con trolled by add ing buffer to uri ne samples. In an alysis of blood,efficie nt removal of macromolecules such as protei ns by orga nic solve nt precipitatio n before injectio n in to an analytical LC column was important in enhancing the performanee and extending column lifetime. Sample derivatization of blood

sample and urine sample before GC：MSanalysis was needed. And methods of collecti on and storage of urine and blood samples were also reviewed.

Key words:traditional Chinese medicine; metabonomics; pretreatme nt

代谢组学（metabonomics）是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后新兴的一种组学方法，是系统生物学的重要组成部分。中药“多组分、多靶点、整合调节作用”的特点与代谢组学整体性、系统性、综合性相吻合。因此，以代谢组学为主体的系统生物学研究方法可能是现代科学中可以概括中医药抽象整体观思想的重要途径。王广基等对

代谢组学技术在中医药关键科学问题研究中的应用前景进行了分析［1］。作者综述了代谢组学技术在中药整体疗效、作用机制及安全性等研究中的应用［2］。

代谢组学研究中的分析手段主要包括核磁共振谱（NMR）气相色谱拟质谱（GC以MS和液相色谱拟质谱（LC拟MS）等各种高通量、高分辨、高灵敏度的谱学技术［3］。NMR由于其具有很高的重现性、一次实验中实现对各种化合物的同时测定、信号强度与其摩尔浓度成正比，可以很容易进行定量分析、借助各种2D A N MR技术可以在对复杂样品不进行进一步分离的前提下实现结构鉴定等诸多优点而被广泛应用［4］。高分辨魔角旋转核磁共振技术（high拟resolution magic拟angle拟spinning NMF^pectroscopy）可以使研究者不经过提取等繁琐的步骤直接对完整的组织进行测定［5］。L C）：MS特

别是

UPLC：Q以TOF/MS^其灵敏度高、分析速度快、样品无需衍生化等优点，受到众多研究者的关注［6］。GC)；MS作为一种经典成熟的分析技术在很多领域中应用广泛，其最大的优势是可以检索多个大型化合物库进行代谢物的结构鉴定，而且这也是代谢组学研究中关键的一个环节。气相色谱拟飞行时间质谱(GC2TOF以MS由于提供了比四级杆质谱更快的分析速度、更高的分辨率和更准确的分子量应用日益广泛

［7］。

可用于代谢组学研究的生物样品包括尿液、血液、脑脊液、组织

和培养液等，最容易获取和应用最广泛的是尿液和血液。人类尿液的pH值一般在5.5〜6.5，但在个别情况下可达4.6〜8.0。尿液的成分主要是极性低分子量代谢物，其中包括羧酸类如柠檬酸、马尿酸；有机胺类如二甲胺(DMA)三甲胺(TMA);氨基酸类如甘氨酸、牛磺酸。NMF 测定时，不同pH值尿液中这些代谢物由于氨基或羧基的解离程度不同，化学位移将发生显著的变化。尿液中还含有一定数量的离子如Na+ (90 〜240 mmol/L)、K+ (34 〜68 mmol/L)等，可能产生不同的离子强度和络合作用，同样对代谢物的化学位移产生影响［8］。血液成分比尿液复杂的多，既包括低分子量成分也包括高分子量物质如蛋白和脂蛋白，LC1MS分析中，蛋白质的存在会严重降低色谱柱的性能和使用寿命［9］。因此，十分有必要在分析前利用适当的方法对样品进行前处理以消除不利因素的影响。本文总结了基于NMRL C)； MS 和

G C)；MS技术代谢组学研究中对尿液和血液样品的前处理方法，希望能为此领域的研究者提供一定的参考。

1尿液和血液的采集与储存

1.1尿液的采集与储存

一般采集于置于冰上同时加入叠氮化钠（NaN3,质量浓度至少为

0.05%）作防腐剂的容器中，冷冻储存于-40 C的环境中［10］。另有研究报道尿液保存在低于-25 C的环境中，26周之内基本不会发生任何改变，而且不需要加入防腐剂，尽管NaN3不会对代谢物产生任何影响。如果要短期（少于1周）储存于4 C的环境中，必须加入NaN3作防腐剂，理想质量浓度为0.1%（终浓度）［11-12］。

1.2血液的采集与储存

收集血液于含有肝素的试管中来制备血浆；收集血液于不含肝素的试管中，冰上凝集来制备血清，离心（1 600 g，15 min，4 C），上清液冷冻储存于-40 C的环境中［10］。Teahan等报道血浆和血清必须尽快与血细胞分离，距离血液采集时间最好不要超过30 min，

以降低血细胞代谢发生的可能性，但是收集血清时凝集时间必须足够长，建议最好不要超过35 min，于冰上凝集可以降低时间延长带来的影响。血浆和血清所含有的代谢物成分基本相同［13］。

2尿液的前处理

2.1 NMR分析中尿液的前处理