代谢组学的研究方法和研究流程
代谢组学的研究方法和研究流程分子微生物学１12３０0０0３林兵
随着人类基因组计划等重大科学项目的实施，基因组学、转录组学及蛋白质组学在研究人类生命科学的过程中发挥了重要的作用，与此同时, 代谢组学(ｍｅtaｂoloｍiｃs）在2０世纪90年代中期产生并迅速地发展起来，与基因组学、转录组学、蛋白质组学共同组成系统生物学。基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等各种组学0在生命科学领域中发挥了重要的作用，它们分别从调控生命过程的不同层面进行研究, 使人们能够从分子水平研究生命现象, 探讨生命的本质, 逐步系统地认识生命发展的规律.这些组学手段加上生物信息学, 成为系统生物学的重要组成部分。
代谢组学的出现和发展是必要的, 同时也是必须的。对于基因组学和蛋白质组学在生命科学研究中的缺点和不足, 代谢组学正好可以进行弥补。代谢组学研究的是生命个体对外源性物质（药物或毒物)的刺激、环境变化或遗传修饰所做出的所有代谢应答, 并且检测这种应答的全貌及其动态变化。代谢组学方法为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段, 同时也为新药临床前安全性评价与实践提供了新的技术支持与保障.
1 代谢组学的概念及发展
代谢组学最初是由英国帝国理工大学Ｊereｍｙ N ichｏｌson教授提出的，他认为代谢组学是将人体作为一个完整的系统，机体的生理病理过程作为一个动态的系统来研究, 并且将代谢组学定义为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定。20０0年，德国马普所的Fｉeｈn等提出了代谢组学的概念，但是与Ｎ ichoｌs ｏn提出的代谢组学不同, 他是将代谢组学定位为一个静态的过程，也可以称为/代谢物组学, 即对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析。同时Ｆieｈn还将代谢组学按照研究目的的不同分为4类: 代谢物靶标分析，代谢轮廓（谱)分析, 代谢组学，代谢指纹分析。现在代谢组学在国内外的研究都在迅速地发展, 科学家们对代谢组学这一概念也进行了完善, 作出了科学的定义: 代谢组学是对一个生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析，从而定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。
与基因组学、转录组学、蛋白质组学相同, 代谢组学的主要研究思想是全局观点。与传统的代谢研究相比, 代谢组学融合了物理学、生物学及分析化学等多学科知识, 利用现代化的先进的仪器联用分析技术对机体在特定的条件下整个代谢产物谱的变化进行检测，并通过特殊的多元统计分析方法研究整体的生物学功能状况。由于代谢组学的研究对象是人体或动物体的所有代谢产物, 而这些代谢产物的产生都是由机体的内源性物质发生反应生成的，因此，代谢产物的变化也就揭示了内源性物质或是基因水平的变化，这使研究对象从微观的基因变为宏观的代谢物，宏观代谢表型的研究使得科学研究的对象范围缩小而且更加直观，易于理解, 这点也是代谢组学研究的优势之一.
代谢组学的优势主要包括：对机体损伤小，所得到的信息量大，相对于基因组学和蛋白质组学检测更加容易。由于代谢组学发展的时间较短, 并且由于代谢组学的分析对象是无偏向性的样品中所有的小分子物质，因此对分析手段的要求比较高, 在数据处理和模式识别上也不成熟，存在一些不足之处。同时生物体代谢物组变化快, 稳定性较难控制，当机体的生理和药理效应超敏时，受试物即使没有相关毒性，也可能引起明显的代谢变化，导致假阳性结果。
代谢组学应用领域大致可以分为以下7个方面：
（1）植物功能基因组研究, 主要以拟南芥为研究模型，也包括一些转基因作物的研究.
（2）疾病诊断, 根据代谢物特征图谱诊断肿瘤、糖尿病等疾病.
（ 3）制药业即新药临床前安全性评价，主要通过高通量比对预测药物的毒性和有效性，通过全面分析来发现新的生物指示剂.
（ 4）微生物领域.
（5)毒理学研究，包括利用代谢组学平台研究环境毒理及药物毒理。
( 6）食品及营养学，即研究食品中进入体内的营养成分及其与体内代谢物的相互作用.
（ 7 ）在中药现代化及其机理上的研究。
2 代谢组学的研究方法
代谢组学的研究过程一般包括代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标记物识别和途径分析等步骤。首先，采集生物样品（如尿液、血液、组织、细胞和培养液等），对其进行生物反应灭活、预处理。再运用先进的分析手段如核磁共振、质谱或色谱等检测样品中所有代谢物的种类、含量、状态，从而得到原始的大量的反映生物样品信息的实验数据，而后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘，从这些复杂大量的信息中筛选出最主要的最能反映代谢物变化的主要成分，再通过模式识别将其与标准的代谢物谱进行比对，或是根据代谢物谱在时程上的变化来寻找生物标记物，研究相关代谢物变化涉及的代谢途径和变化规律, 以阐述生物体对相应刺激的响应机制。同时由于不同分析手段各有其特点，在不同应用领域使用的分析方法也是有所不同的。
2。1 核磁共振技术
核磁共振( nuclearmａgnetiｃ reｓonaｎce，NMR )是有机结构测定的四大谱学之一, 作为一种分析物质的手段, 由于其可深入物质内部而不破坏样品，并具有迅速、准确、分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用。在代谢组学发展的早期， NMＲ技术被广泛应用在毒性代谢组学的研究中。ＮMR 的优势在于能够对样品实现无创性、无偏向的检测，具有良好的客观性和重现性, 样品不需要烦琐处理，具有较高的通量和较低的单位样品检测成本。此外, １Ｈ—NMＲ对含氢化合物均有响应, 能完成样品中大多数化合物的检测, 满足代谢组学中的对尽可能多的化合物进行检测的目标。
NMＲ虽然可对复杂样品如尿液、血液等进行非破坏性分析，与质谱法相比, 它的缺点是检测灵敏度相对较低(采用现有成熟的超低温探头技术，其检测灵敏度在纳克级水平）、动态范围有限，很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物；同时，购置仪器所需的投资也较大。为了改进NＭR检测灵敏度较低的缺点，可采用高分辨核磁共振技术或使用多维核磁共振技术和液相色谱- 核磁共振联用（LC-NMR）。魔角旋转（mａgｉcangle sp ｉnninｇ，MAＳ)核磁共振技术是20世纪90 年代初发展起来的一种新型的核磁共振技术，在代谢组学的研究中,魔角旋转核磁共振波谱技术已被成功地应用到研究生物组织上，因为生物组织在核磁共振实验中会由于磁化率不均匀、分子运动受限等因素而引起谱线增宽.这些因素利用固体核磁共振中的ＭAＳ方法可以消除。例如大鼠肝脏、哺乳动物肾脏以及大鼠睾丸组织等.
２。2 质谱联用技术
ＧC—MS是代谢组学常用的方法,原先主要应用于植物组学研究，随着代 }工程和分析技术的快速发展，其在微生物代谢组学的应用越来越引起关注.GC—MS的分离效率高,易于使用且较为经济,特别是采用标准的电子轰击（EI）模式后，其使用范围和重复性都进一步提高。
但是GC—MS需要对挥发性较低的代谢物进行衍生化预处理，这一步骤会耗费额外的时间，甚至引起样品的变化。受此限制，GC—MS无法分析热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。近来，多维分离技术如二级气相色谱飞行时间质谱（GＣ—GC—ＴOF—MS）,检测范围更广，但由于实际应用困难和花费较高等问题使其并未普遍使用。第1篇关于微生物代谢组学的文献报道了应用3种不同的ＧC—ＭS技术,分析肠系膜明串珠菌发酵生产葡聚糖过程中脂肪酸、氨基酸和糖类以监测微生物污染。
ＬC—ＭS无需进行样品的衍生化处理，检测范围广,可以作为GＣ—ＭS的补充，非常适合于生物样本中低挥发性或非挥发性、热稳定性差的代谢物。LC与电喷雾（ＥSＩ）质谱连用可以分析大部分极性代谢物,此外，离子配对(IP）LC—MS、亲水相互作用液相色谱ＨILI Ｃ—MS、反相ＬＣ—ＭＳI等可以进行不同种类代谢物的及时定量分析。Breｒａu等利用H ＩＬIC—MＳ获得了大肠杆菌和酿酒酵母饥饿胁迫应答的代谢指纹图谱，测出68种胞内代谢物的浓度发生了改变。ＬC—ESI—MS—MＳ分析被用于测量葡萄糖冲击下的酿酒酵母的糖分解和三羧酸循环中间代谢产物。
ＣE—MS分离样品效率比普通的色谱质谱联用要高得多,仅需要极少的进液量（ｎL），而且其测试时问短，试剂成本低。ＣE-ＭS在微生物代谢组领域发挥着越来越重要的作用。O ｈashｉ等［221通过CＥ—TOF—ＭＳ对大肠杆菌的阴离子和阳离子代谢产物进行了全面分析和定量，鉴别出主要代谢物中的37５个亲水性中问体,并对其中的198个代谢物进行了定量。Ｈarada等运用反相电渗流（ＥOF)CＥ—ＭS高效分离了辅酶A、有机酸、核苷酸和磷酸糖.So ｇa等用CE—MS系统研究了枯草杆菌在芽孢发生过程中的代谢谱的变化过程,识别出1692种代谢物，并鉴别出其中的15０种。
3 代谢组学的研究流程
代谢组学研究的技术平台一般流程包括样品制备、代谢产物的检测和分析鉴定、数据分析与模型建立.下图为代谢组学的流程图
微生物代谢物样品的制备一般分为微生物培养、淬灭和代谢产物的提取。根据研究对象、目的和采用的分析技术不同,所需的样品提取和预处理方法各异,不存在一种普适性的标准化方法。
在样品淬灭和代谢物的提取过程中,应遵循的原则是：(1)淬灭工艺最好可以立即冻结细胞代谢。（2）在淬灭过程中要求细胞膜无明显损伤，以免胞内代谢物外泄。（3）提取过程中应该尽可能多的提取胞内代物。（4)代谢产物不应该遇到任何物理或化学修饰。（5)得到的样品基质应与所选择的分析方法相容.冷甲醇和液氮是最常用的淬灭方法，而在提取方面由于特定的提取条件往往仅适合某些类化合物，目前尚无一种能够适合所有代谢产物的提取方法。应该根据不同的化合物选择不同的提取方法，并对提取条件进行优化.
2 代谢产物的分析鉴定
生命科学领域的巨大进步与先进分析技术密不可分，进行代谢组学研究首要解决的是分析方法上的理论和技术问题。传统的酶法定量胞内外代谢物只能分析一个样品中的一个或几个代谢物,且需要的样品体积大。而胞内代谢物'浓度一般很低，在淬灭或提取过程中又会
被稀释,所得的样品体积一般很少，这些都将严重影响酶法定量的可靠性。代谢组学定量胞内外代谢物的分析方法要求具有高灵敏度、高通量和无偏向性的特点。在分析复杂的胞内外产物时，所选用的分析方法是十分重要的，一般根据样品的特性和试验目的，选择最合适的分析方法。目前最常用的分离分析手段是气相色谱与质谱联用（GC—MS)、液相色谱与质谱联用（ＬＣ—MS）、毛细管电泳与质谱联用(CE—MS)以及核磁共振(ＮMR)。
３数据分析策略
在代谢组学研究中，大多数是从检测到的代谢产物信息中进行两类（如基因突变前后的响应）或多类（如不同表型问代谢产物)的判别分类以及生物标记物的发现。由于生物样品的组成复杂,在得到分析对象的原始谱图后,首先需要对数据进行预处理(归一化和滤噪）,消除干扰因素,保留有用信息.数据的解析可分为如下3个基本步骤:(1)提取出色谱分离(如ＧC—MＳ)后未能有效分开的代谢物峰并得出其相应浓度；(２)根据其保留时间及质谱图等信息鉴别有效峰所代表的化合物；（３)根据代谢数据建立代谢网络模型。
4 展望
代谢组学的出现在宏观方面弥补了基因组学、蛋白质组学等微观研究中的缺点, 并且随着分析手段和数据分析方面的不断完善，代谢组学得到的关于机体的所有信息都将得到全面的解读，通过这种大量信息的检测, 筛查出与药物或是临床相关的生物标记物将是代谢组学发展的重要领域.相信代谢组学将会与临床、新药开发等的联系越来越紧密, 发挥其重要的作用。