中药代谢组学研究中生物样品前处理方法

摘要 :总结中药代谢组学研究中生物样品 (尿液 、血液 )的前处理方法 ,主要包括 :尿液中加入缓冲液提 供相同的 pH值和离子强度 ,保持代谢物化学位移的恒定 。利用有机溶剂沉淀法除去血液中的大分子 物质 ,增加色谱柱的性能和使用寿命 。血液和尿液样品在进行 GC2M S分析前要进行衍生化处理 。同 时 ,对尿液和血液的采集与储存方法进行了总结 。 关键词 :中药 ;代谢组学 ;样品前处理 中图分类号 : R 284 文献标识码 : A doi: 10. 3969 / j. issn. 1006 - 8783. 2010. 04. 029 文章编号 : 1006 - 8783 (2010) 04 - 0434 - 04
1 尿液和血液的采集与储存
1. 1 尿液的采集与储存 一般 采 集 于 置 于 冰 上 同 时 加 入 叠 氮 化 钠
(NaN3 ,质量浓度至少为 0. 05% )作防腐剂的容器 中 ,冷冻储存于 - 40 ℃的环境中 [ 10 ] 。另有研究报 道尿液保存在低于 - 25℃的环境中 , 26周之内基本 不会发生任何改变 ,而且不需要加入防腐剂 ,尽管 NaN3 不会对代谢物产生任何影响 。如果要短期 (少 于 1周 )储存于 4 ℃的环境中 ,必须加入 NaN3 作防 腐剂 ,理想质量浓度为 0. 1% (终浓度 。 ) [ 11 - 12 ] 1. 2 血液的采集与储存
在中医药关键科学问题研究中的应用前景进行了分 析 [ 1 ] 。作者综述了代谢组学技术在中药整体疗效 、 作用机制及安全性等研究中的应用 [ 2 ] 。
代谢组学研究中的分析手段主要包括核磁共振 谱 (NMR ) 、气相色谱 2质谱 ( GC2M S)和液相色谱 2质 谱 (LC2M S)等各种高通量 、高分辨 、高灵敏度的谱学 技术 [ 3 ] 。NMR由于其具有很高的重现性 、一次实验 中实现对各种化合物的同时测定 、信号强度与其摩 尔浓度成正比 ,可以很容易进行定量分析 、借助各种 2D 2NMR 技术可以在对复杂样品不进行进一步分离 的前提 下 实 现 结 构 鉴 定 等 诸 多 优 点 而 被 广 泛 应 用 [ 4 ] 。高 分 辨 魔 角 旋 转 核 磁 共 振 技 术 ( high2 resolution m agic2angle2sp inning NMR spectroscopy)可
收集血液于含有肝素的试管中来制备血浆 ;收 集血液于不含肝素的试管中 ,冰上凝集来制备血清 ,
离心 (1 600 g, 15 m in, 4 ℃) ,上清液冷冻储存于 40 ℃的环境中 [ 10 ] 。 Teahan等报道血浆和血清必须 尽快与血细胞分离 ,距离血液采集时间最好不要超 过 30 m in,以降低血细胞代谢发生的可能性 ,但是收 集血清时凝集时间必须足够长 ,建议最好不要超过 35 m in,于冰上凝集可以降低时间延长带来的影响 。 血浆和血清所含有的代谢物成分基本相同 [ 13 ] 。
广东药学院学报
Jou rna l of Guangdong Pha rm aceu tica l College Aug. 2010, 26 ( 4)
中药代谢组学研究中生物样品前处理方法
邹忠杰 1 ,梁生旺 1 ,袁经权 2 ,龚梦鹃 1
( 1. 广东药学院 中药学院 ,广东 广州 510006; 2. 中国医学科学院 药用植物研究所广西分所 , 广西 ,南宁 530023)
代谢组学 (metabonom ics)是继基因组学 、转录 组学和蛋白质组学后新兴的一种组学方法 ,是系统 生物学的重要组成部分 。中药“多组分 、多靶点 、整 合调节作用 ”的特点与代谢组学整体性 、系统性 、综 合性相吻合 。因此 ,以代谢组学为主体的系统生物 学研究方法可能是现代科学中可以概括中医药抽象 整体观思想的重要途径 。王广基等对代谢组学技术
收稿日期 : 2010 - 06 - 13 基金项目 :广东省教育厅高水平科研项目 (自然科学 ) (粤财
教 [ 2009 ]400号 ) 作者简介 :邹忠杰 ( 1980 - ) ,男 ,博士 ,从事天然活性物质的
发现与评价研究 , Email: zouzhongjie@ hotmail. com。
第 4期
邹忠杰 ,等. 中药代谢组学研究中生物样品前处理方法
435
以使研究者不经过提取等繁琐的步骤直接对完整的 组织进行测定 [ 5 ] 。LC2M S特别是 U PLC2Q 2TOF /M S 以其灵敏度高 、分析速度快 、样品无需衍生化等优 点 ,受到众多研究者的关注 [ 6 ] 。 GC2M S作为一种经 典成熟的分析技术在很多领域中应用广泛 ,其最大 的优势是可以检索多个大型化合物库进行代谢物的 结构鉴定 ,而且这也是代谢组学研究中关键的一个 环节 。气相色谱 2飞行时间质谱 ( GC2TOF2M S)由于 提供了比四级杆质谱更快的分析速度 、更高的分辨 率和更准确的分子量应用日益广泛 [ 7 ] 。
尿液中的成分主要是极性低分子量代谢物 ,同 时含有少量的各种细胞 、微量的大分子物质及磷酸 盐 、硫酸盐等各种盐类物质 ,这些都有可能对 LC2MS 分析产生一定的影响 。最简单的尿液处理方式是仅 用 0. 22μm 分析滤膜过滤 ,这可以最大限度保留尿
436
广东药学院学报
第 26卷
液中的代谢物 [ 15 ] 。为降低尿液基质的干扰 ,也可以 用蒸馏水进行稀释 ( 1∶1 ～1 ∶4,体积比 ) [ 16 - 17 ] ,但有 可能降低信号强度 ,部分低含量的代谢物可能检测 不到 [ 15 ] 。综合考虑检测到的代谢物的数量 、重现性 及除去微量蛋白质和各种盐类物质的能力 ,Wong等 建议尿液用甲醇 ( 1 ∶1,体积比 )进行稀释 [ 18 ] 。尿液 可以先冷冻干燥然后用有机溶剂如甲醇进行提取 , 这种方法可以获得重现性比较高的结果 ,而且操作 简单 [ 19 ] 。但是这种方法可能会改变尿液的代谢指 纹 ,一方面是由于很难完全溶解冻干产品 ,另一方面 是由于挥发性成分的丢失 [ 11 ] 。 2. 3 GC2M S分析中尿液的前处理
Pretrea tm en t m ethods of b iolog ica l sam ples in the study of m etabonom ics of trad itiona l Ch inese m ed ic ine
ZOU Zhong2J ie1 , L IANG Sheng2W ang1 , YUAN J ing2Quan2 , GONG M eng2Juan1 ( 1. S chool of T rad itiona l Chinese Байду номын сангаас edicine, Guangdong Pharm aceutical College, Guangdong Guangzhou 510006, China; 2. Guangx i S ta tion of Institu te of M edicinal P lant D evelopm en t, Chinese A cadem y of M edica l S ciences, N ann ing, Guangxi 530023, Ch ina)
2 尿液的前处理
2. 1 NMR分析中尿液的前处理 如前所述 ,尿液 pH 值和离子强度的变化引起
化学位移的变化是 NMR 测定中的首要问题 。加入 缓冲液一方面提供尽可能相同的 pH 环境 ,另一方 面减少离子强度不同带来的化学位移的变化 ,文献 [ 10 ]报道 了尿 液详 细的预 处 理 方 法 。首 先 配 制 pH7. 4磷酸缓冲液 : 称取 28. 85 g Na2 HPO4、5. 25 g NaH2 PO4 、1 mmol/L TSP2d4 和 3 mmol/L N aN3 置于 1 L 容量瓶中 ,加入 200 mL D2 O ,然后用水稀释至 1 L ,强烈震摇使盐全部溶解 。400μL 尿液中加入 200 μL磷酸缓冲液 ,离心 ( 12 000 g, 5 m in, 4 ℃) ,上清 液 550μL 转移至 5 mm 核磁管中 。雄黄的安全性 评价中采用了类似的方法 : 400 μL 尿液中加入 200 μL 磷 酸 缓 冲 液 ( 0. 2 mol/L Na2 HPO4 /0. 2 mol/L NaH2 PO4 , pH7. 4 ) , 静 置 20 m in, 离 心 ( 3 500 g, 5 m in, 4 ℃) 。上清液 500μL 加入 50μL TSP2d4 /D2O ( 1 mmo l/L 终浓度 ) [ 14 ] 。Lauridsen 等 [ 11 ] 报道对于 一般的尿液样品缓冲液终浓度要达到 0. 3 mol/L ,对 于浓缩的样品要达到 1 mol/L ,才能较好地保持代谢 物化学位移的一致性 。上述磷酸缓冲液中 , 由于 Na2 HPO4 ·12H2 O 较低的水溶性 ( 4. 2 g /100 g, 20 ℃) ,因此不可能实现高浓度的缓冲 ,缓冲液与尿样 的比例为 1∶2,这必然对样品进行了一定的稀释 ,从 而降低了测定中的信噪比 ( SNR) ,而且低温储存时 , Na2 HPO4 ·12H2 O 容易析出 。X iao等报道了一种改 进的缓冲体系 : K2 HPO4 /NaH2 PO4 (pH 7. 4, 1. 5 mol/ L ) ,缓冲液与尿样的比例为 1 ∶10,可更好保持化学 位移一致性 ,提高信噪比 ,减少样品稀释 ,并且可低 温储存 [ 8 ] 。 2. 2 LC2M S分析中尿液的前处理
可用于代谢组学研究的生物样品包括尿液 、血 液 、脑脊液 、组织和培养液等 ,最容易获取和应用最 广泛的是尿液和血液 。人类尿液的 pH 值一般在 515～6. 5,但在个别情况下可达 4. 6～8. 0。尿液的 成分主要是极性低分子量代谢物 ,其中包括羧酸类 如柠檬酸 、马尿酸 ;有机胺类如二甲胺 (DMA ) 、三甲 胺 ( TMA ) ;氨基酸类如甘氨酸 、牛磺酸 。NMR 测定 时 ,不同 pH 值尿液中这些代谢物由于氨基或羧基 的解离程度不同 ,化学位移将发生显著的变化 。尿 液中还含有一定数量的离子如 Na+ (90～240 mmol/ L ) 、K+ (34～68 mmol/L )等 ,可能产生不同的离子 强度和络合作用 ,同样对代谢物的化学位移产生影 响 [ 8 ] 。血液成分比尿液复杂的多 ,既包括低分子量 成分也包括高分子量物质如蛋白和脂蛋白 , LC2M S 分析中 ,蛋白质的存在会严重降低色谱柱的性能和 使用寿命 [ 9 ] 。因此 ,十分有必要在分析前利用适当 的方法对样品进行前处理以消除不利因素的影响 。 本文总结了基于 NMR、LC2M S和 GC2M S技术代谢 组学研究中对尿液和血液样品的前处理方法 ,希望 能为此领域的研究者提供一定的参考 。