第六章 荧光分光光度法
分析化学-原子吸收与原子荧光
（二） Graphite furnace atomizer 石墨炉原子化器
1. 构造：
2. 分析过程
T
Time drying ashing atomizing cleaning
干燥-----灰化-----原子化----净化
paring with flame atomizer
原子化原理 原子化效率 试样体积 固体进样 灵敏度 重现性 背景干扰 分析速度
1. Hollow cathode lamp
2. Electrodeless discharge lamp
mg MX
400Pa Ar 3 ~ 8 cm
10mm
As, Cd, Pb, Se, Zn, Hg, P, Sn, Te, Tl…...
二、 原子化器 Atomizer
M（* 激发态原子）
MX（试样）
消除方法： 1. 稀释待测溶液 2. 采用标准加入法进行定量 3. 配制与试样溶液物理性质相似的
标准溶液
五、背景吸收 Background absorption
背景吸收包括： 分子吸收、光散射、火焰气体吸收。 背景吸收干扰主要存在于石墨炉原子化器。
减小背景吸收的方法：
减小进样量 增加灰化温度和灰化时间 增加石墨管内气流 采用基体改进剂 (增加共存物的挥发性或 降低待测元素的挥发性）
Characteristics: ☆Sensitivity ☆Selectivity ☆Analysis speed ☆Application:
determination of (metal) elements
§1. 原子吸收光谱法基本原理
一、原子吸收光谱的产生 1.原子能级跃迁 Atomic energy level transition
荧光分光光度法的名词解释
荧光分光光度法的名词解释荧光分光光度法是一种常用于分析化学领域的光谱分析技术。
它主要利用物质在受到紫外光激发后吸收能量并发射出可见光的特性进行定量和定性分析。
一、荧光现象解析1. 光激发与光发射在荧光分光光度法中，样品通常处于低能量状态，并能吸收特定波长的紫外光。
当样品受到紫外光激发后，部分激发态的分子会跃迁至高能量的激发态。
而在分子返回低能量态的过程中，会发射出比激发态能级较低的可见光，形成荧光现象。
这可用于分析样品的组成、浓度、结构及化学性质等。
2. 荧光寿命荧光寿命是指物质从受到激发到光发射结束所经过的时间。
荧光分光光度法可通过测量样品中发射的荧光光强随时间的变化，计算出荧光寿命。
荧光寿命与物质的环境、浓度、分子结构等因素有关，因此可以用来定量分析。
二、荧光分光光度法的原理1. 荧光光谱分析荧光分光光度法通过测量样品的荧光光谱来分析物质的成分和性质。
利用荧光光谱可以确定荧光发射的波长范围，并对不同波长处的发射强度进行测量。
这些荧光光谱图可以用来确定物质的定性和定量分析。
2. 荧光光度法荧光光度法利用荧光光度计测量样品的荧光强度和荧光寿命。
荧光光度计通常包含紫外-可见光源、光栅或单色仪、荧光探测器等。
样品受到激发后发射的荧光光通过光栅或单色仪进行分光，然后荧光探测器测量各个波长处的荧光强度。
这种光度计可提供高灵敏度和准确的荧光测量结果。
三、荧光分光光度法的应用1. 化学分析荧光分光光度法广泛应用于化学分析领域。
它可以通过测量荧光光谱和荧光强度，实现对物质浓度的定量测定，如荧光显微分析、荧光光谱分析、化学发光等。
此外，荧光分光光度法还可用于监测环境中的有毒物质和污染物。
2. 生物医学研究荧光分光光度法在生物医学研究中也具有重要应用。
例如，可以利用荧光探针与特定的生物分子结合，实现对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的定性和定量分析。
此外，荧光分光光度法在药物研究、生物标记物探测、细胞成像等方面也发挥重要作用。
第六章 仪器分析 荧光分析法
第6章 荧光分析法
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低 振动能级→基态（ T1 → S0跃迁）。
1.基本原理
无辐射跃迁方式 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式 由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。
内转换：能量差较小的激发态之间，部分能量 重叠，激发态由高电子能级转移至低电子能级 的无辐射能级交换。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生 相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使 荧光或磷光减弱或“猝灭”。 体系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间 的非辐射跃迁。
2.荧光分光光度计
（2）单色器 选择激发光波长的第一单色器 选择发射光(测量)波长的第二单色器
（3）样品池
低荧光的玻璃或石英 方形适用于90°测量 （4）检测器 光电倍增管 （5）读出装臵
2.荧光分光光度计
2.2 仪器的校正
(1)灵敏度校正 (2)波长校正 (3)激发光谱和荧光光谱的校正
3.分析方法 3.1 荧光强度与物质浓度的关系
1.基本原理
（3）影响荧光强度的外部因素
① 温度 温度升高，荧光物质的荧光效率和荧光 强度下降。 其中一个原因是分子的内部能量转化作 用。当激发分子接受额外热能时，有可能使 激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振 动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞 频率增加，使外转换的去活几率增加。
1.基本原理
1.基本原理
1.基本原理
6. 荧光分光光度法
芴 φ= 1.0 C H 2
3,4-苯并芘
( 强荧光物质)
刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶
剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素
和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚 酞却没有。
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和 刚性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH
OH OH
荧光灵敏 度（最大 吸收波长） 0.066
喹啉硫酸氢盐 (0.05mol· L-1H2SO4) 罗丹明B （酒精） 荧光素 （0.1mol· L-1NaOH 四 溴 荧 光 素 （0.1mol· L-1NaOH
544
571
0.17
0.88
490
515
0.20
1.0
518
540
0.18
0.19
硫堇 (0.05mol· L-1H2SO4)
芳香族化合物。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
（3） 刚性平面结构
-O O -O O C O
C
COO-
COO-
酚酞(无荧光)
荧光素
O
N Mg N O
N O-
8－羟基喹啉(弱荧光)
红色荧光
联二苯 φ= 0.2
仪 器 光 路 图
15:41:25
• 激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个 波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧 灯. • 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 • 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中 样品池用石英或低荧光的玻璃材料.
荧光分光光度法的原理
荧光分光光度法的原理荧光分光光度法是一种常用的分析技术，主要用于测定物质中的荧光发射强度。
它基于荧光物质吸收能量后发生激发态转变的原理，通过测量样品在不同波长下发射的荧光强度来分析物质的成分和浓度。
荧光分光光度法的原理基于荧光现象，即物质在吸收辐射能量后，会从基态跃迁到激发态，然后再发射出荧光。
这种荧光发射的波长和强度与物质的结构和环境有关，因此可以通过测量荧光的特性来获得样品的信息。
荧光分光光度法的基本装置包括激发源、选择性的滤光片或光栅、样品池和荧光检测器。
激发源通常使用紫外光或可见光，其波长可以根据待测样品的特性进行选择。
滤光片或光栅用于选择特定的波长范围，以便测量样品在该波长下的荧光强度。
样品池用于容纳待测样品，并通过光路使激发光和荧光光进入检测器进行测量。
在进行荧光分光光度测量时，首先需要选择适当的激发光源和荧光检测器，以及调节合适的滤光片或光栅。
然后将待测样品放入样品池中，使其与激发光发生作用。
样品吸收激发光后，发生激发态转变，并发射出荧光。
荧光光通过滤光片或光栅进行选择性筛选，然后进入荧光检测器进行测量。
荧光分光光度法的应用十分广泛。
在生物医学领域，它常用于荧光染料的检测和荧光标记的分析。
在环境监测中，荧光分光光度法可以用来检测水中的有机物污染物。
此外，荧光分光光度法还可以用于食品检测、药物分析、环境污染监测等领域。
荧光分光光度法相比于其他分析技术具有许多优点。
首先，它具有极高的灵敏度，可以检测到很低浓度的物质。
其次，荧光分光光度法对样品的破坏较小，可以进行非破坏性分析。
此外，荧光分光光度法还具有选择性和快速性的特点，可以同时测定多个物质。
然而，荧光分光光度法也存在一些局限性。
首先，荧光分光光度法对样品的环境要求较高，如温度、pH值等因素都会影响荧光强度。
其次，荧光分光光度法在样品有强荧光背景的情况下，可能会受到干扰。
此外，荧光分光光度法对荧光物质的选择性较差，容易受到其他物质的影响。
第六章__荧光分光光度法
·
显示器
二、主要部件及功能
1．光源 ．
高压汞蒸气灯，氙灯。 能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度 计光源大得多。
2．激发光单色器 ．
作用：提供单波长的激发光。 色散元件：棱镜或光栅。 出射狭缝宽度可调 。
3．样品池 ．
须用石英材料制成。
4．荧光单色器 ．
将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧 光通过。 出射狭缝宽度可调。
一、应用： 应用：
1.定量分析 能产生荧光 或能形成荧光配合物的物质。 2.简单定性 回答“是不是”。
二、特点： 特点：
灵敏度高，比吸收光谱法高10³~104倍。ppb 选择性比吸收光谱法好。
第二节 基本原理
一、分子荧光的产生 物质吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然 后再回到基态 释放能量⒈以热能的形式。⒉以光辐 射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这 种现象称为光致发光。
pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。 【例】 苯胺 pH7～12时，发兰色荧光。 pH﹤2或PH﹥13时，无荧光。
所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。
4．溶剂 ． 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。
三、定量分析的特点及应用
灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt 级（10-12）。 选择性好，与能产生荧光的物质少有关。
5．检测器 ．
光电转换元件，测定荧光的强度。 检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的 干扰。 由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。
第四节 定量分析
一、定量方法
一般采用工作直线法。作C—F直线。
F
C
荧光分光光度法
荧光分光光度法2015年版《药典》四部通则0405某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。
物质的激发光谱和荧光发射光谱，可用于该物质的定性分析。
当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用于该物质的含量测定。
荧光分光光度法的灵敏度一般较紫外-可见分光光度法高，但浓度太高的溶液会发生“自熄灭”现象，而且在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分光光度法应在低浓度溶液中进行。
测定法所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各品种项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并制备对照品溶液和供试品溶液。
通常荧光分光光度法是在一定条件下，测定对照品溶液荧光强度与其浓度的线性关系。
当线性关系良好时，可在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度；然后在相同的条件下，分别读取对照品溶液及其试剂空白的荧光强度与供试品溶液及其试剂空白的荧光强度，用下式计算供试品浓度：为供试品溶液的浓度；式中 cX为对照品溶液的浓度；cr为供试品溶液的荧光强度；Rx为供试品溶液试剂空白的荧光强度；RXb为对照品溶液的荧光强度；RrRrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度。
因荧光分光光度法中的浓度与荧光强度的线性较窄，故（Rx -RXb）/（Rr-Rrb）应控制在0.5～2之间为宜，如若超过，应在调节溶液浓度后再进行测定。
当浓度与荧光强度明显偏离线性时，应改用标准曲线法进行含量测定。
对易被光分解或弛豫时间较长的品种，为使仪器灵敏度定标准确，避免因激发光多次照射而影响荧光强度，可选择一种激发光和发射光波长与供试品近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液。
例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等。
在测定供试品溶液时选择适当的基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
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核磁波谱法
一、应用：
1.定量分析 能产生荧光 或能形成荧光配合物的物质。 2.简单定性 回答“是不是”。
二、特点：
灵敏度高，比吸收光谱法高10³ 4倍。ppb ~10
选择性比吸收光谱法好。
第二节 基本原理
一、分子荧光的产生 物质吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然 后再回到基态 释放能量⒈以热能的形式。⒉以光辐 射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这 种现象称为光致发光。
第六章 荧光分光光度法
基本要求： 了解荧光光谱法的基本原理和应用 特点。了解荧光分光光度计的组成以及 特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。 了解影响荧光强度的因素。
第一节 概论
回顾： 电化学分析法 四大类 光学分析法 色谱分析法 其它分析方法
原子光谱法
分子光谱法 X射线光谱法
紫外-可见光分光光度法 荧光分光光度法 红外吸收光谱法 拉曼光谱法
λ(nm)
三、分子荧光与分子结构的关系
分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。
能产生荧光的分子具有的结构特点：
共轭双键 刚性平面 多环结构
C H2
【例】
芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。
四、荧光强度与浓度的关系
F=2.303ΦI0εbc
Φ：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。 I0：入射光强度 ε：摩尔吸光系数 b： 光程 c：浓度
检测器
·
显示器
二、主要部件及功能
1．光源
高压汞蒸气灯，氙灯。 能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度 计光源大得多。
2．激发光单色器
作用：提供单波长的激发光。 色散元件：棱镜或光栅。 出射狭缝宽度可调 。
3．样品池
须用石英材料制成。
4．荧光单色器
将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧 光通过。 出射狭缝宽度可调。
公式成立前提条件：εbc=A<0.05
即：当试样浓度较低时（c<0.05/εb），C与F方成 线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生 无辐射去激活，造成线性偏离。）
第三节 荧光分光光度计
一、基本结构示意图
样品池
光源 激发光单色器
荧光单色器
特点：1 ．光源方向与检测方向成直角； 2 ．二 激发光谱
固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F) 所作的光谱曲线。
【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。
F
300
350
400
λ(nm)
⒉ 发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F 所作的光谱曲线。
【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。
F
300
350
400
二、问答题
试述分子荧光产生的过程。 试述分子荧光强度与浓度的关系式，并 说明公式成立的前提条件及原因。 分别说明荧光分光光度计两个单色器的 作用，以及将光路设计成直角方向的原 因。 为什么可见光分光光度计的光路是直线 方向，而荧光分光光度计的光路是直角 方向？
荧光分析的激发光谱和 发射光谱分别提供了哪 些定量分析信息？核黄 素的激发光谱（实线） 和发射光谱（虚线）如 图所示，对核黄素进行 荧光定量分析时，最佳 的激发光波长和荧光波 长各为多少？ 为什么？
所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。
4．溶剂 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。
三、定量分析的特点及应用
灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt 级（10-12）。 选择性好，与能产生荧光的物质少有关。
思考题
一、概念 （荧光）激发光谱 （荧光）发射光谱 原子发射光谱是在原子化过程中自然发 射的谱线 而原子荧光光谱是用另一波 长的谱线去激发原子发出与自然发射不 同的另一波长的谱线
5．检测器
光电转换元件，测定荧光的强度。 检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的 干扰。 由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。
第四节 定量分析
一、定量方法
一般采用工作直线法。作C—F直线。
F
C
⑴配制一系列待测成分的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5 ⑵测出相应的荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5 ⑶建立工作直线（ F →C） ①作图法 ②回归法 ⑷测量待测样品，得F样 ①从工作直线上找到待测成分的浓度C样 ②由回归方程计算出C样
激发态 无辐射跃迁 亚稳态（三重态） 荧 光 磷 光 基态
最常见的光致发光：荧光和磷光。
两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～ 10-6秒，磷光寿命10-3～10秒。 荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的 原子产生，本章介绍分子荧光。 由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光 谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可 见光区。
二、影响荧光强度测定的因素
1．激发光照射 有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F↓。 所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在 测定时才打开光闸让激发光照射样品池。 2．温度 温度↑，荧光效率下降，F↓。（因为，温度↑，增加分子间 碰撞机会而使能量消耗掉。）
3．pH值
pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。 【例】 苯胺 pH7～12时，发兰色荧光。 pH﹤2或PH﹥13时，无荧光。