荧光分光光度法
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荧光分光光度法
整理课件
在生物、医药、环境和石油工业等诸多 领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能 直接或间接地分析众多的有机化合物，而且 还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机 元素的测定。
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随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质被进一步揭 开。
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射之后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
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a. 直接比较法
设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为
FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或
Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。
但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
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不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
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3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱
荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
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a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
在生物、医药、环境和石油工业等诸多 领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能 直接或间接地分析众多的有机化合物，而且 还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机 元素的测定。
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随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质被进一步揭 开。
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射之后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
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a. 直接比较法
设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为
FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或
Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。
但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
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不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
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3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱
荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
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a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
实验二 荧光分光光度法测定富里酸
实验二荧光分光光度法测定富里酸——一实验目的与要求1、了解荧光分光光度计的基本组成结构，并学会操作使用；2、掌握荧光分光光度法定量分析的基本原理。
二实验原理富里酸（FA）在水中是一种荧光物质，并且在低浓度时，荧光强度与FA浓度呈正比：I f = kc基此，测定一系列已如浓度的富里酸的荧光强度，然后以荧光强度对富里酸浓度作标准曲线，再测定未知浓度富里酸的荧光强度，把它代入标准曲线方程求出其浓度。
图1富里酸的分子结构三仪器、药品及材料F-7000型分子荧光分光光度计，吸收池，容量瓶，移液枪；富里酸，去离子水四实验步骤1．系列标准溶液的配制准确称取0.2500g富里酸，加入少量水溶解，移至250mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
此富里酸溶液浓度为1.000g·L-1。
取6只100 mL的容量瓶分别加入1.000g·L-1的富里酸标准液0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL,，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
2．绘制激发光谱和发射光谱在200-500 nm范围内扫描荧光激发光谱。
在300-600 nm范围内扫描荧光发射光谱。
3. 绘制标准曲线荧光激发波长固定在340 nm处，荧光发射波长固定在420 nm处，从发射光谱上测定系列标准溶液的荧光发射强度。
4．未知试样的测定在标准系列溶液同样条件下，测定未知样品的荧光发射强度。
5．绘制荧光强度I f对富里酸溶液浓度c的标准曲线，并由标准曲线求算未知试样的浓度。
五数据处理1．原始数据标准溶液未知液样品编号 1 2 3 4 5 6 x浓度/(mg∙L-1) 0 2 4 6 8 10荧光强度-0.029 0.230 0.462 0.675 0.916 1.122 0.774 2．标准曲线绘制和未知样品含量计算。
得到富里酸荧光强度与浓度的关系曲线为y=0.1147x-0.0106，测得未知液荧光强度为0.774，即0.774=0.1147x-0.0106得：x=6.84所以未知样品浓度为6.84mg∙L-1六实验注意事项1、试液的浓度不要太高。
6. 荧光分光光度法
芴 φ= 1.0 C H 2
3,4-苯并芘
( 强荧光物质)
刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶
剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素
和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚 酞却没有。
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和 刚性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH
OH OH
荧光灵敏 度（最大 吸收波长） 0.066
喹啉硫酸氢盐 (0.05mol· L-1H2SO4) 罗丹明B （酒精） 荧光素 （0.1mol· L-1NaOH 四 溴 荧 光 素 （0.1mol· L-1NaOH
544
571
0.17
0.88
490
515
0.20
1.0
518
540
0.18
0.19
硫堇 (0.05mol· L-1H2SO4)
芳香族化合物。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
（3） 刚性平面结构
-O O -O O C O
C
COO-
COO-
酚酞(无荧光)
荧光素
O
N Mg N O
N O-
8－羟基喹啉(弱荧光)
红色荧光
联二苯 φ= 0.2
仪 器 光 路 图
15:41:25
• 激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个 波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧 灯. • 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 • 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中 样品池用石英或低荧光的玻璃材料.
第八章 荧光分光光度法与检测技术
39
第八章 荧光分析法检测技术与应用
2. 用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2.00g食品，用 10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释 为10.0ml。维生素B2氯仿标准溶液浓度为0.100µg/ml。测得空白溶液、 标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F0=1.5，Fs=69.5，Fx=61.5， 求该食品中维生素B2的含量（μg/g）。
32
第八章 荧光分析法检测技术与应用
5. 下列叙述中，错误的是（ ）。 A、荧光分析的待测物应含有大π键 B、紫外分光光度法待测物应含有π键 C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低 6. 下列因素会导致荧光效率下降的有（ ）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
19
第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
➢ 最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
➢强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
➢ 影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
18
第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
第八章 荧光分析法检测技术与应用
2. 用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2.00g食品，用 10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释 为10.0ml。维生素B2氯仿标准溶液浓度为0.100µg/ml。测得空白溶液、 标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F0=1.5，Fs=69.5，Fx=61.5， 求该食品中维生素B2的含量（μg/g）。
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
5. 下列叙述中，错误的是（ ）。 A、荧光分析的待测物应含有大π键 B、紫外分光光度法待测物应含有π键 C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低 6. 下列因素会导致荧光效率下降的有（ ）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
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第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
➢ 最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
➢强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
➢ 影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度法
荧光效率（φf）=
2、分子结构与荧光的关系 A 长的共轭结构 例 激发光 荧光 205nm 278nm 286nm 321nm 0.29 356nm 404nm 0.36
荧光效率 0.11
B 分子的刚性和共平面性
荧光效率：0.2
1.0
C 取代基：给电子基团使荧光效率增大，如 -OH、-OCH3、-NH2等。
表面吸 光物质
F
问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 单色器
I0
λex
I
表面吸 光物质
λem 单色器
检测器
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 强度F与激发波长之间的关系。
单色器 F荧光的产生
（1）振动弛豫：同一电子能级电子从高的 振动能级到最低的振动能级。
电子能级
原因：分子碰撞 结果：热能，无辐射
振动能级
（2）内部能量的转移
产生原因：受激分子常由高电子能级以无辐射 （热）跃迁方式转移至低电子能级。
电子能级 振动能级
（3）荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换 及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低 能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到 基态的任一能级。 第二激发态 第一激发态
散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定 有干扰，使其读数增大。
荧 光 光 谱
散 射 光 谱
不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 溶剂 水 248 271 313 350 365 416 405 469 436 511
乙醇
环已烷 四氯化 碳 氯仿
267
267 — —
344
荧光分光光度法
表面吸 光物质
问题（ ） 问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 ） 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度 单色器 I0 λex λem 单色器 检测器 I
表面吸 光物质
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 、激发光谱：荧光 不变时， 强度F与激发波长之间的关系 与激发波长之间的关系。 强度 与激发波长之间的关系。
定性、 ③TLC定性、定量 定性
§2 原理 一、分子荧光产生 1、分子的电子能级： 、分子的电子能级：
C = C −C = C
ψ4 π*
π*
ψ3 ψ2 ψ1
π
π
三线态与单线态比较： 三线态与单线态比较： UV 基态单线态 ① 单线态 ②三线态
激发态 E2<E1 ，ε2<ε1， ② 的寿命可达 秒，而①的 的寿命可达1秒 寿命为10 跃迁几率① 寿命为 -8，跃迁几率①是②的106倍。
三、荧光与分子结构的关系 荧光物质发生荧光的过程： 荧光物质发生荧光的过程： A 荧光物质对光的吸收 B通过无辐射跃迁，跃迁到第一电子激发态 通过无辐射跃迁， 通过无辐射跃迁 的最低振动能级。 的最低振动能级。 C 跃迁至基态各振动能级 D 各振动能级分子，通过无辐射跃迁回基 各振动能级分子， 态的最低振动能级。 态的最低振动能级。
引起荧光熄灭的形式： 引起荧光熄灭的形式： 碰撞熄灭： 碰撞熄灭：由于碰撞而损失能量 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 生成新的化合物。 生成新的化合物。 体系间跨越：单线态变成三线态。 体系间跨越：单线态变成三线态。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。
问题（ ） 问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 ） 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度 单色器 I0 λex λem 单色器 检测器 I
表面吸 光物质
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 、激发光谱：荧光 不变时， 强度F与激发波长之间的关系 与激发波长之间的关系。 强度 与激发波长之间的关系。
定性、 ③TLC定性、定量 定性
§2 原理 一、分子荧光产生 1、分子的电子能级： 、分子的电子能级：
C = C −C = C
ψ4 π*
π*
ψ3 ψ2 ψ1
π
π
三线态与单线态比较： 三线态与单线态比较： UV 基态单线态 ① 单线态 ②三线态
激发态 E2<E1 ，ε2<ε1， ② 的寿命可达 秒，而①的 的寿命可达1秒 寿命为10 跃迁几率① 寿命为 -8，跃迁几率①是②的106倍。
三、荧光与分子结构的关系 荧光物质发生荧光的过程： 荧光物质发生荧光的过程： A 荧光物质对光的吸收 B通过无辐射跃迁，跃迁到第一电子激发态 通过无辐射跃迁， 通过无辐射跃迁 的最低振动能级。 的最低振动能级。 C 跃迁至基态各振动能级 D 各振动能级分子，通过无辐射跃迁回基 各振动能级分子， 态的最低振动能级。 态的最低振动能级。
引起荧光熄灭的形式： 引起荧光熄灭的形式： 碰撞熄灭： 碰撞熄灭：由于碰撞而损失能量 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 生成新的化合物。 生成新的化合物。 体系间跨越：单线态变成三线态。 体系间跨越：单线态变成三线态。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。
荧光分光光度法
第二节 分子荧光强度的影响因素
一、荧光与有机化合物的结构
1. 跃迁的类型 对于有机荧光物质: 对于有机荧光物质: n →π* εmax＜ 100 平均寿命10 平均寿命10-5~10-7sec π→π* εmax≥104 平均寿命10 平均寿命10-7~10-9sec kS → T小 π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 强荧光的有机化合物具备下特征: 强荧光的有机化合物具备下特征 具有大的共轭π键结构 键结构； ①具有大的共轭 键结构； 具有刚性的平面结构； ②具有刚性的平面结构； ③具有最低的单重电子激发态为S1为π * →π型； 具有最低的单重电子激发态为 型 取代基团为给电子取代基。 ④取代基团为给电子取代基。
4 3 2 1
S0
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
λex =290nm (MAX)
λ
λem= 620nm(MAX) 620nm(MAX)
2. 三维荧光光谱 I F ∝f (λex 、λem) 固定发射波长、扫描激发波长 固定发射波长、
1−
It = 1 −T = 1 − e−2.303εbC I0
I0 − It = I0 ( 1− e−2.303εbC )
荧光强度（ 与相应的吸光分数成正比： 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：
IF =φ( I0 − It ) = φI0 ( 1− e−2.303εbC )
按照级数展开式： 按照级数展开式：
C. 激发光谱与发射 光谱的镜像关系
4 3 2 1
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
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3）Kc受环境因素的影响最为强烈， 主要影响是T。
∴随T变大碰撞变多，无辐射去激活 的几率增大。Kc增大。 大量实验证实：大多数分子，随T升 高。Ф f会变小。
2）信息多: 激发分光光谱（信 息同于 UV）、发射光光谱的发 光强度、发光寿命、量子效率、 荧光偏振等多种信息 ,定性更好;
3）工作曲线的线性范围宽（定量 更准） 应用范围也广微量元素的 分析、医药、环境,石油工业等能 直接或间接分析众多的有机物
4）专一性强：许多物质的测定采 用间接法.
伯乐公司的Labeled DNA 的荧光标 记物 Labeling kits.
? 一般来说系内交换的几率愈 大小取决于：
? 最低能量受激单一态与三重 态的能量间隔愈小;
? 最低能量受激单一态的寿命 愈长 ,(即发射光子愈慢 ) 几 率愈大。
7）磷光 phosphorescence 受激三重态上的粒子回到单一态 基态的形式是被禁戒的 .但还是可 发生的 原因：寿命很长(10-3S)及Δ E小.
2.荧光分析法主要应用范围
1）生物技术的分析 ,免疫技术的分 析,如DNA、抗体、抗原等; 2）痕量元素的分析，如 70多种无 机元素； 3）间接测定众多的有机物，包括 药物。
荧光分析一般分为三种：
1.X射线荧光分析（X射线） 2.原子荧光分析（激光） 3.分子荧光分析（汞弧灯）
3.优势
1）灵敏度高：比 UV高2~~3个 数量级.
荧光分光光度法
Flourescence 一. 简介 :
二.荧光发光的原理 : 三.量子效率 :
四. 荧光发光光谱仪的构造： 五. 荧光的定量分析：
六. 荧光光度计的发展
简介
1.和UV异同点 2.荧光分析法主要
应用范围与常用方法 3.优势
1.与UV异同点
1)构造与UV很相似. 属于分光光度法,光源.单色器等 2)组件的布置稍有不同 荧光采用激发光和发射光 成直角的直角光路., 3)原理也不一样.这在后面介绍
一态；
B .激发过程中自旋方向被倒转或改变了，
则为三重态； C.三重态的能量比相应的单一态高，但 能量差要低 .应该到三重态 .
D.单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒，
跃迁几率为单重态向单一态的 10-6。
3）振动驰豫 Vibratory Relaxation 溶质分子向溶剂转移过剩的振动能
吸收跃迁所需的时间很短 (10-15S)， 分子具有的几何形状及所处的环境还 来不及改变 ，可能发生两种变化
荧光发光的原理:
激发和发射过程 1.激发过程： ①基态：能量最低状态 S0 ②激发态:电子处于反键轨道上为激 发态
最有意义的为 π ?π *和n?π *过程
电子激发过程很快，10-15 S， 不稳定。
2.发射过程
当激发态在返回基态时，伴有光子 的辐射称为发光过程，又称发射过 程。
荧光和磷光均为此种光致发光 过程。(又称冷光)
4）荧光 Fluorescence
分子处于受激态的最低振动能 级后，变化之一发射光子回到基态 ---荧光
波长：荧光光谱>吸收光谱
量子效率 φ : 受激单一态的寿命在 10-9~10-7 ，若无其他竞争，则全部 受激分子发射荧光，φ =1；
实际有竞争，0---1之间
5）内转换:
(IC)Inter Crossing
①直接从激发回到基态（发射光子） 10-9~10-7S ②发射辐射前改变振动能级.
10-11~10-13S
溶质分子向溶剂转移过剩的振动能 而发生的分子驰豫是相当快的，在 10-11~10-13S 就能无辐射而降落到 受激态最低振动能级，因为快，所 以溶液中分子快速振动驰豫后，光 子发射总是由受激态的最低振动能 级发生的。
1）单一态 激发过程中,当S=0时为单一态. ①S原子光谱谱项符号量子数 S 的 2S+1表示谱项的多重性， ②自旋量子数ms（电子） 可取值只有± 1/2（即顺旋或反旋） ③自旋的两种状态: 当自旋配对时.S=0，不配对则S=1
2）三重态. S=1则2S+1=3
A.跃迁时通常自旋不变，即单一态 ? 单
总结:原理2步 ①激发λ ex, ②发射λ em,发时竞争
(jablonskii)杰不朗斯基的图解
三.量子效率:(在定量计算先讨论 Ф)
? 影响发生的因素总的是内交换.(IC 和ISC)。衡量发生的效率如何前已 提到，以量子效率Ф 来判断；数值 在0—1。其公式为
? 公式 Ф=
kf
kf ? kc ? kx
Kf大小影响Ф f的大小
3.影响k的因素:
1）Kf为最低受激单一态与基态之间 跃迁几率大小的量度。
Δ ε max(摩尔吸光系数)
当ε max变小时.可预期Kf也相应变小； π ?π *吸收带的ε max大于n?π *, 大约大10倍. ∴π ?π *的Kf远比后者大
2）Kx ISC的几率的大小强烈依赖单 一态和三重态之间的能量大小。能量 差愈小，则ISC几率大，Kx变大
A. 全部激发能转变为热 .而本身 回到基态 ,即受激单一态与基态 间转换，为低效率过程 ;
B. 受激单一态间 (能量不同的单 一态 )的内转换则为多得多的几 率过程.(主要）
6）系内转换(ISC)
ISC:单一态与三重态间的转换
对三重态布居粒子的高效途径 是与回到基态发生争夺。
状态的改变是禁戒的，但发射 光子回到基态需要 10-9--10-7S, 而内交换只需 10-13S,比发射光 子的时间更短.所以系内交换可 与荧光发射进行竞争。
? k：为速率常数,竞争由时间的快慢 起重要作用,因此以其各影响因素的 速率常数体现.
?
Hale Waihona Puke fФ= k f ? k c ? k x
Kf:荧光发生过程 Kx: 系内交联的ISC过程
Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失 过程或讲将其激发能转变为热能过程的 IC过程。
Kf>>Kc和Kx Ф f-?1， Kc或Kx>> Kf 则Ф f-?0 无荧光
实际从激发态回到基态过程充 满竞争。
(jablonskii) 杰不朗斯基的图解
S: 基态 S*激发态 S0、基态 F :荧光 P:磷光 S1:为单一态的低能级 T: 三重态Three VR:振动驰豫Vibratory Relaxation 内转换 ： Inter Crossing 系内转换：
Inter System Crossing
∴随T变大碰撞变多，无辐射去激活 的几率增大。Kc增大。 大量实验证实：大多数分子，随T升 高。Ф f会变小。
2）信息多: 激发分光光谱（信 息同于 UV）、发射光光谱的发 光强度、发光寿命、量子效率、 荧光偏振等多种信息 ,定性更好;
3）工作曲线的线性范围宽（定量 更准） 应用范围也广微量元素的 分析、医药、环境,石油工业等能 直接或间接分析众多的有机物
4）专一性强：许多物质的测定采 用间接法.
伯乐公司的Labeled DNA 的荧光标 记物 Labeling kits.
? 一般来说系内交换的几率愈 大小取决于：
? 最低能量受激单一态与三重 态的能量间隔愈小;
? 最低能量受激单一态的寿命 愈长 ,(即发射光子愈慢 ) 几 率愈大。
7）磷光 phosphorescence 受激三重态上的粒子回到单一态 基态的形式是被禁戒的 .但还是可 发生的 原因：寿命很长(10-3S)及Δ E小.
2.荧光分析法主要应用范围
1）生物技术的分析 ,免疫技术的分 析,如DNA、抗体、抗原等; 2）痕量元素的分析，如 70多种无 机元素； 3）间接测定众多的有机物，包括 药物。
荧光分析一般分为三种：
1.X射线荧光分析（X射线） 2.原子荧光分析（激光） 3.分子荧光分析（汞弧灯）
3.优势
1）灵敏度高：比 UV高2~~3个 数量级.
荧光分光光度法
Flourescence 一. 简介 :
二.荧光发光的原理 : 三.量子效率 :
四. 荧光发光光谱仪的构造： 五. 荧光的定量分析：
六. 荧光光度计的发展
简介
1.和UV异同点 2.荧光分析法主要
应用范围与常用方法 3.优势
1.与UV异同点
1)构造与UV很相似. 属于分光光度法,光源.单色器等 2)组件的布置稍有不同 荧光采用激发光和发射光 成直角的直角光路., 3)原理也不一样.这在后面介绍
一态；
B .激发过程中自旋方向被倒转或改变了，
则为三重态； C.三重态的能量比相应的单一态高，但 能量差要低 .应该到三重态 .
D.单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒，
跃迁几率为单重态向单一态的 10-6。
3）振动驰豫 Vibratory Relaxation 溶质分子向溶剂转移过剩的振动能
吸收跃迁所需的时间很短 (10-15S)， 分子具有的几何形状及所处的环境还 来不及改变 ，可能发生两种变化
荧光发光的原理:
激发和发射过程 1.激发过程： ①基态：能量最低状态 S0 ②激发态:电子处于反键轨道上为激 发态
最有意义的为 π ?π *和n?π *过程
电子激发过程很快，10-15 S， 不稳定。
2.发射过程
当激发态在返回基态时，伴有光子 的辐射称为发光过程，又称发射过 程。
荧光和磷光均为此种光致发光 过程。(又称冷光)
4）荧光 Fluorescence
分子处于受激态的最低振动能 级后，变化之一发射光子回到基态 ---荧光
波长：荧光光谱>吸收光谱
量子效率 φ : 受激单一态的寿命在 10-9~10-7 ，若无其他竞争，则全部 受激分子发射荧光，φ =1；
实际有竞争，0---1之间
5）内转换:
(IC)Inter Crossing
①直接从激发回到基态（发射光子） 10-9~10-7S ②发射辐射前改变振动能级.
10-11~10-13S
溶质分子向溶剂转移过剩的振动能 而发生的分子驰豫是相当快的，在 10-11~10-13S 就能无辐射而降落到 受激态最低振动能级，因为快，所 以溶液中分子快速振动驰豫后，光 子发射总是由受激态的最低振动能 级发生的。
1）单一态 激发过程中,当S=0时为单一态. ①S原子光谱谱项符号量子数 S 的 2S+1表示谱项的多重性， ②自旋量子数ms（电子） 可取值只有± 1/2（即顺旋或反旋） ③自旋的两种状态: 当自旋配对时.S=0，不配对则S=1
2）三重态. S=1则2S+1=3
A.跃迁时通常自旋不变，即单一态 ? 单
总结:原理2步 ①激发λ ex, ②发射λ em,发时竞争
(jablonskii)杰不朗斯基的图解
三.量子效率:(在定量计算先讨论 Ф)
? 影响发生的因素总的是内交换.(IC 和ISC)。衡量发生的效率如何前已 提到，以量子效率Ф 来判断；数值 在0—1。其公式为
? 公式 Ф=
kf
kf ? kc ? kx
Kf大小影响Ф f的大小
3.影响k的因素:
1）Kf为最低受激单一态与基态之间 跃迁几率大小的量度。
Δ ε max(摩尔吸光系数)
当ε max变小时.可预期Kf也相应变小； π ?π *吸收带的ε max大于n?π *, 大约大10倍. ∴π ?π *的Kf远比后者大
2）Kx ISC的几率的大小强烈依赖单 一态和三重态之间的能量大小。能量 差愈小，则ISC几率大，Kx变大
A. 全部激发能转变为热 .而本身 回到基态 ,即受激单一态与基态 间转换，为低效率过程 ;
B. 受激单一态间 (能量不同的单 一态 )的内转换则为多得多的几 率过程.(主要）
6）系内转换(ISC)
ISC:单一态与三重态间的转换
对三重态布居粒子的高效途径 是与回到基态发生争夺。
状态的改变是禁戒的，但发射 光子回到基态需要 10-9--10-7S, 而内交换只需 10-13S,比发射光 子的时间更短.所以系内交换可 与荧光发射进行竞争。
? k：为速率常数,竞争由时间的快慢 起重要作用,因此以其各影响因素的 速率常数体现.
?
Hale Waihona Puke fФ= k f ? k c ? k x
Kf:荧光发生过程 Kx: 系内交联的ISC过程
Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失 过程或讲将其激发能转变为热能过程的 IC过程。
Kf>>Kc和Kx Ф f-?1， Kc或Kx>> Kf 则Ф f-?0 无荧光
实际从激发态回到基态过程充 满竞争。
(jablonskii) 杰不朗斯基的图解
S: 基态 S*激发态 S0、基态 F :荧光 P:磷光 S1:为单一态的低能级 T: 三重态Three VR:振动驰豫Vibratory Relaxation 内转换 ： Inter Crossing 系内转换：
Inter System Crossing