荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计)教学提纲

• 光源 • 滤光片 • 光路 • 聚光器 • 镜头 • 图像采集系统
荧光光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯
滤色系统： 激发滤色片：置于光源与物镜之间，用于选择激发光范 围，只有能激发荧光染料发光的特定波长 的光通过。 阻挡滤色片：物镜和目镜之间，选择性通过特异的荧 光，呈现专一的荧光色彩。
光路
透射荧光显微镜光路(a)
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用 干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起 不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利 通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在 标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重 迭或杂质掩盖，影响判断。
荧光分光光度计的基本结构是 : 光源 单色器或滤光片 样品池 单色器或滤光片 检测器荧光分光 Nhomakorabea度计原理图
注意事项：
（1） 注意开机顺序。 （2） 注意关机顺序。 （3） 为延长仪器使用寿命，扫描速度、负高
压、狭缝的设置一般不宜选在高档。 （4） 关机后必须半小时（等氙灯温度降下）
方可重新开机。
8 荧光技术的应用
（四）封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮
度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和 0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。
（五）镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜
油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石 蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
荧光技术
韩东洺 细胞生物学科
2014-11-5
1 荧光和荧光素
利用较短波长的光(激发光)照射样品，使样品 受到高能量激发，产生较长波长的荧光(发射光)， 用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位 置。
2 常见荧光素：
（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) （2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) （3）四甲基异硫氰酸罗丹明
6 使用荧光显微镜的注意事项
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改 变程序。
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压 汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗 室，再开始观察标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强 度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光 也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) （4）镧系 （5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）
（6）多甲藻叶绿素蛋白 （peridinin chlorophyll protein， PerCP）
（7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）
（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“-”—无或可见微 弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明 亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。
7 荧光分光光度计
荧光分光光度计工作原理：
由光源氙狐灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发 光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光 物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照 射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放 大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动 的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅， 固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波 长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱 （emission spectrum），简称荧光光谱。
落射荧光显微镜光路(b)
透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反
射进入物镜。
5 荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸 收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
3 合适荧光素的选择：
(1)具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 (2)荧光效率高，标记后下降不明显。 (3) 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 (4)标记后能保持生物学活性和免疫活性。 (5)标记方法简单、快速。 (6)安全无毒
4 荧光显微镜（fluorescence microscope）
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一 些附件(如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器和阻断 滤片等)的基础上组成的。
（1） 免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的
物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术 对其进行分析的方法。
将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的 抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。
当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适 当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的 激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱 （emission spectrum）。
当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所 选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择的荧光波长 处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节 省时间， 保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始 就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后 才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标 本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间防止封 裱剂蒸发。