荧光分光光度法
荧光分光光度法的名词解释
荧光分光光度法的名词解释荧光分光光度法是一种常用于分析化学领域的光谱分析技术。
它主要利用物质在受到紫外光激发后吸收能量并发射出可见光的特性进行定量和定性分析。
一、荧光现象解析1. 光激发与光发射在荧光分光光度法中，样品通常处于低能量状态，并能吸收特定波长的紫外光。
当样品受到紫外光激发后，部分激发态的分子会跃迁至高能量的激发态。
而在分子返回低能量态的过程中，会发射出比激发态能级较低的可见光，形成荧光现象。
这可用于分析样品的组成、浓度、结构及化学性质等。
2. 荧光寿命荧光寿命是指物质从受到激发到光发射结束所经过的时间。
荧光分光光度法可通过测量样品中发射的荧光光强随时间的变化，计算出荧光寿命。
荧光寿命与物质的环境、浓度、分子结构等因素有关，因此可以用来定量分析。
二、荧光分光光度法的原理1. 荧光光谱分析荧光分光光度法通过测量样品的荧光光谱来分析物质的成分和性质。
利用荧光光谱可以确定荧光发射的波长范围，并对不同波长处的发射强度进行测量。
这些荧光光谱图可以用来确定物质的定性和定量分析。
2. 荧光光度法荧光光度法利用荧光光度计测量样品的荧光强度和荧光寿命。
荧光光度计通常包含紫外-可见光源、光栅或单色仪、荧光探测器等。
样品受到激发后发射的荧光光通过光栅或单色仪进行分光，然后荧光探测器测量各个波长处的荧光强度。
这种光度计可提供高灵敏度和准确的荧光测量结果。
三、荧光分光光度法的应用1. 化学分析荧光分光光度法广泛应用于化学分析领域。
它可以通过测量荧光光谱和荧光强度，实现对物质浓度的定量测定，如荧光显微分析、荧光光谱分析、化学发光等。
此外，荧光分光光度法还可用于监测环境中的有毒物质和污染物。
2. 生物医学研究荧光分光光度法在生物医学研究中也具有重要应用。
例如，可以利用荧光探针与特定的生物分子结合，实现对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的定性和定量分析。
此外，荧光分光光度法在药物研究、生物标记物探测、细胞成像等方面也发挥重要作用。
荧光分光光度法
在生物、医药、环境和石油工业等诸多 领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能 直接或间接地分析众多的有机化合物，而且 还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机 元素的测定。
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随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质被进一步揭 开。
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射之后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
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a. 直接比较法
设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为
FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或
Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。
但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
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不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
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3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱
荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
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a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
6. 荧光分光光度法
芴 φ= 1.0 C H 2
3,4-苯并芘
( 强荧光物质)
刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶
剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素
和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚 酞却没有。
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和 刚性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH
OH OH
荧光灵敏 度（最大 吸收波长） 0.066
喹啉硫酸氢盐 (0.05mol· L-1H2SO4) 罗丹明B （酒精） 荧光素 （0.1mol· L-1NaOH 四 溴 荧 光 素 （0.1mol· L-1NaOH
544
571
0.17
0.88
490
515
0.20
1.0
518
540
0.18
0.19
硫堇 (0.05mol· L-1H2SO4)
芳香族化合物。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
（3） 刚性平面结构
-O O -O O C O
C
COO-
COO-
酚酞(无荧光)
荧光素
O
N Mg N O
N O-
8－羟基喹啉(弱荧光)
红色荧光
联二苯 φ= 0.2
仪 器 光 路 图
15:41:25
• 激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个 波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧 灯. • 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 • 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中 样品池用石英或低荧光的玻璃材料.
第八章 荧光分光光度法与检测技术
第八章 荧光分析法检测技术与应用
2. 用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2.00g食品，用 10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释 为10.0ml。维生素B2氯仿标准溶液浓度为0.100µg/ml。测得空白溶液、 标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F0=1.5，Fs=69.5，Fx=61.5， 求该食品中维生素B2的含量（μg/g）。
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
5. 下列叙述中，错误的是（ ）。 A、荧光分析的待测物应含有大π键 B、紫外分光光度法待测物应含有π键 C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低 6. 下列因素会导致荧光效率下降的有（ ）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
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第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
➢ 最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
➢强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
➢ 影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
荧光分光光度法
∴随T变大碰撞变多，无辐射去激活 的几率增大。Kc增大。 大量实验证实：大多数分子，随T升 高。Ф f会变小。
2）信息多: 激发分光光谱（信 息同于 UV）、发射光光谱的发 光强度、发光寿命、量子效率、 荧光偏振等多种信息 ,定性更好;
3）工作曲线的线性范围宽（定量 更准） 应用范围也广微量元素的 分析、医药、环境,石油工业等能 直接或间接分析众多的有机物
4）专一性强：许多物质的测定采 用间接法.
伯乐公司的Labeled DNA 的荧光标 记物 Labeling kits.
? 一般来说系内交换的几率愈 大小取决于：
? 最低能量受激单一态与三重 态的能量间隔愈小;
? 最低能量受激单一态的寿命 愈长 ,(即发射光子愈慢 ) 几 率愈大。
7）磷光 phosphorescence 受激三重态上的粒子回到单一态 基态的形式是被禁戒的 .但还是可 发生的 原因：寿命很长(10-3S)及Δ E小.
2.荧光分析法主要应用范围
1）生物技术的分析 ,免疫技术的分 析,如DNA、抗体、抗原等; 2）痕量元素的分析，如 70多种无 机元素； 3）间接测定众多的有机物，包括 药物。
荧光分析一般分为三种：
1.X射线荧光分析（X射线） 2.原子荧光分析（激光） 3.分子荧光分析（汞弧灯）
3.优势
1）灵敏度高：比 UV高2~~3个 数量级.
荧光分光光度法
Flourescence 一. 简介 :
二.荧光发光的原理 : 三.量子效率 :
四. 荧光发光光谱仪的构造： 五. 荧光的定量分析：
六. 荧光光度计的发展
简介
1.和UV异同点 2.荧光分析法主要
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度法
荧光效率（φf）=
2、分子结构与荧光的关系 A 长的共轭结构 例 激发光 荧光 205nm 278nm 286nm 321nm 0.29 356nm 404nm 0.36
荧光效率 0.11
B 分子的刚性和共平面性
荧光效率：0.2
1.0
C 取代基：给电子基团使荧光效率增大，如 -OH、-OCH3、-NH2等。
表面吸 光物质
F
问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 单色器
I0
λex
I
表面吸 光物质
λem 单色器
检测器
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 强度F与激发波长之间的关系。
单色器 F荧光的产生
（1）振动弛豫：同一电子能级电子从高的 振动能级到最低的振动能级。
电子能级
原因：分子碰撞 结果：热能，无辐射
振动能级
（2）内部能量的转移
产生原因：受激分子常由高电子能级以无辐射 （热）跃迁方式转移至低电子能级。
电子能级 振动能级
（3）荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换 及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低 能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到 基态的任一能级。 第二激发态 第一激发态
散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定 有干扰，使其读数增大。
荧 光 光 谱
散 射 光 谱
不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 溶剂 水 248 271 313 350 365 416 405 469 436 511
乙醇
环已烷 四氯化 碳 氯仿
267
267 — —
344
荧光分光光度法测定荧光素的含量
荧光分光光度法测定荧光素的含量一、实验目的1.学习荧光分光光度法测定荧光素的分析原理。
2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素的方法。
二、实验原理荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。
在稀溶液中，荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
三、仪器及试剂1．仪器RF-5301PC 荧光分光光度计；2．试剂荧光素（分析纯）；四、操作步骤1.标准溶液配制准确称取0.0125g 荧光素标样，配制成500ml 溶液，则此溶液浓度为0.025g/L.移取此溶液10.0ml ，于50ml 容量瓶中用蒸馏水稀释bcI I F εφ0303.2=KcI F =至刻度。
分别移取此溶液 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，于50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。
2.光谱的绘制(1)荧光光度计操作打开主机电源开关，预热大约30分钟。
开启氙灯。
(2)荧光素激发光谱的绘制，参数设置如下：①设定纵坐标②设定灵敏度；③设定扫描速度；④发射波长EMISSION Wavelength；⑤激发波长范围；⑥将某一浓度的荧光素标液置于试样池中；⑦扫描得到激发光谱。
(3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下：①设定纵坐标②设定灵敏度；③设定扫描速度；④设定激发波长EXCITION Wavelength (从激发光谱曲线中)得到；⑤发射波长范围EMISSION Wavelength；⑥将1号标准溶液放入试样池中；⑦扫描得到荧光光谱。
仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。
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荧光分光光度法
目的：检测色氨酸和糠氨酸的荧光值
检测限：原料奶巴氏灭菌乳中、复原乳最低含量10%，UH T灭菌乳中复原乳最低含量为20%
优缺点：灵敏度高，检测时间短，但稳定性差设、备昂贵，对于长时间存放的UH T灭菌乳检测性较差
高效液相色谱法
检测乳制品中糠氨酸的含量
原料奶巴氏灭菌乳中、复原乳最低含量10%UH T灭菌乳中复原乳最低含量为40%
准确度和精确度高但样品前处理时间长色谱柱造价高
近红外光谱法
比较物质光谱与待测成分含量间的线形或非线形模型
原料奶中复原乳最低含量10%
分析时间短，约为1min，易受光路条件影响且要建立校正模型，不能进行痕量组分分析
紫外分光光度法
检测原料奶中乳清蛋白，-乳白蛋α白，-乳球蛋白的β含量
原料奶中乳清蛋白，-乳白蛋白，-乳球蛋αβ白的含量显著高于复原乳
实验步骤繁琐，UHT乳中复原乳的检测限为20%
AOAC化学法
检测乳制品中酪蛋白的含量
掺加复原乳后酪蛋白含量降低
检测时间短，灵敏度高
牛乳被誉为营养价值最接近于完善的食物，人均乳制品消费量是衡量一个国家人民生活水平的主要指标之一。
世界上许多国家都对乳制品消费给予高度注视，加以引导和鼓励。
在我国乳制品也逐渐成为人民生活的必须食品。
据市场调查结果显示，目前城市居民食用乳制品的普及率已经达到95%以上，全国原奶加工产能有9000万吨，而国内奶源供应量仅有不足3600万吨，巨大的奶源缺口，成为乳制品安全的漏洞。
也是大量再制牛乳涌入市场的原因。
天然牛乳与再制牛乳的物理性状极其相似，而营养成分与风味又不尽相同。
如何鉴别天然牛乳与再制牛乳的风味，有助于消费者更好的认识乳制品的营养价值，从而进一步的提高人民的生活水平。
天然牛奶被誉为“万食之王”，因为它不仅含有其他食物所含的全部营养，而且含有世上千万种食物所没有的生物活性物质。
生物活性物质在天然牛奶中的含量很少，但就营养而言，可以“四两拨千斤”！常喝牛奶能够提高人体免疫力，便是活性物质在起作用。
因此，天然牛奶被称为“命脉素”。
营养学家分析，每100克天然牛乳中。
含蛋白质3.1克，脂肪3.5克，碳水化合物6克，灰分0.7克，钙120毫克，磷90毫克。
铁0.1毫克，硫胺素0.04毫克，核黄素0.13毫克，尼克酸0.2 毫克，抗坏血酸1毫克，维生素A140单位。
天然牛乳的蛋白质主要是含磷蛋白质——酪蛋白，也含白蛋白及球蛋白，此3种蛋白质均含全部必需氨基酸。
天然牛乳的脂肪主要是棕榈酸、硬脂酸的甘油酯，也含少量低级脂肪酸，此外还含少量卵磷脂、胆甾醇、色素等。
再制牛乳是指把牛奶浓缩、干燥成为浓缩乳或乳粉，再添加适量水，制成与原乳中水、固体物比例相当的乳液。
再制牛乳要经过两次高温灭菌加工。
加工通常采用UHT（超高温灭菌）法，要经过130℃－－150℃超高温灭菌。
一方观点：采用超高温灭菌法不仅破坏了天然牛乳中的全部物质和大部分维生素，还会使容易被人吸收的钙离子与牛奶的酪蛋白结合，形成不易被人吸收的络合物。
因此，“再制牛乳”中的营养物质，其实只是在米、面、肉等食品中大量存在的普通蛋白质、脂肪和糖等能量类物质，与鲜牛奶的差距不言而喻。
另一方持不同的观点：超高温灭菌法虽然采取高温灭菌，但高温时间只是瞬时的，因此不会大量破坏鲜奶中的营养成分。
无论何种观点，不难看出再制牛乳的风味较天然牛乳而言发生了变化。
本文就是通过对乳制品的风味鉴别，来进一步的得出天然牛乳与再制牛乳的优劣。
主要研究内容：天然牛乳的风味与再制牛乳的风味
目标：通过风味鉴别实验明确天然牛乳与再制牛乳风味
研究方法：通过感官评定来品评天然牛乳与再制牛乳风味，异常风味，芳香味，等特征
通过高效液相色谱法来确定天然牛乳与再制牛乳的风味物质,酸类、羰基化合物、酯类、硫化物、萜类等，及其差别。
终上两种方法对天然牛乳和再制牛乳进行鉴别与评价。