荧光分光光度分析法
荧光光度分析法及药物分析
荧光光度分析法与药物分析化材院化工3班姚依弟10081224前言当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的光，而当紫外光停顿照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。
利用这种能够反映物质特性的荧光对该物质进展定性和定量分析的方法称为荧光分析法。
荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光，激发的完成是由于光的吸收。
吸收与荧光密切相关，因为吸收必须先于荧光发射。
由于碰撞和热的耗散常使一局部吸收能丧失，剩余荧光的能量比吸收的能量小，因此荧光在更长的波长发射。
【一】荧光分光光度法的分析方法荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色法和分光光度法。
比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几；而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的。
荧光分析法的另一优点是选择性高。
荧光分析法还有方法快捷，重现性好，取样容易，试样需要少等优点。
荧光分析法也有它的缺乏之处，主要是指它比起其它方法来说应用X围还不够广泛，因为有许多物质本身不会产生荧光。
为使荧光分析法的应用更加广泛，开展了各类荧光分析方法，如对不发荧光的物质可通过某类化学反响使其转变为适合测定的荧光物质，对荧光较弱的物质可采取荧光增敏分析法。
荧光分析法可分为直接荧光测定法和间接荧光测定法。
直接测定法是利用物质自身发射的荧光进展定量测定。
但是自身发荧光的药物寥寥无几，所以一般采用间接法测定。
1、直接荧光分析法直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的药物。
因荧光性质与溶液的EF值有关，故荧光强度的测定需在适宜的EF缓冲溶液中进展。
对于成分复杂的生物供试品，为了防止干扰，有时需利用萃取、沉淀、色谱别离等方法除去干扰物，以降低荧光空白本底，提高分析灵敏度。
已用于直接荧光分析法的药物有盐酸洛哌丁胺、双水杨酯、左旋溶肉瘤素、叶酸等。
本身能发荧光的物质,可用荧光分光光度法直接测定。
鲍霞认为可用荧光分光光度法直接测定氧氟沙星胶囊的含量。
荧光分光光度法
在生物、医药、环境和石油工业等诸多 领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能 直接或间接地分析众多的有机化合物，而且 还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机 元素的测定。
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随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质被进一步揭 开。
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射之后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
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a. 直接比较法
设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为
FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或
Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。
但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
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不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
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3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱
荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
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a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
实验二 荧光分光光度法测定富里酸
实验二荧光分光光度法测定富里酸——一实验目的与要求1、了解荧光分光光度计的基本组成结构，并学会操作使用；2、掌握荧光分光光度法定量分析的基本原理。
二实验原理富里酸（FA）在水中是一种荧光物质，并且在低浓度时，荧光强度与FA浓度呈正比：I f = kc基此，测定一系列已如浓度的富里酸的荧光强度，然后以荧光强度对富里酸浓度作标准曲线，再测定未知浓度富里酸的荧光强度，把它代入标准曲线方程求出其浓度。
图1富里酸的分子结构三仪器、药品及材料F-7000型分子荧光分光光度计，吸收池，容量瓶，移液枪；富里酸，去离子水四实验步骤1．系列标准溶液的配制准确称取0.2500g富里酸，加入少量水溶解，移至250mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
此富里酸溶液浓度为1.000g·L-1。
取6只100 mL的容量瓶分别加入1.000g·L-1的富里酸标准液0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL,，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
2．绘制激发光谱和发射光谱在200-500 nm范围内扫描荧光激发光谱。
在300-600 nm范围内扫描荧光发射光谱。
3. 绘制标准曲线荧光激发波长固定在340 nm处，荧光发射波长固定在420 nm处，从发射光谱上测定系列标准溶液的荧光发射强度。
4．未知试样的测定在标准系列溶液同样条件下，测定未知样品的荧光发射强度。
5．绘制荧光强度I f对富里酸溶液浓度c的标准曲线，并由标准曲线求算未知试样的浓度。
五数据处理1．原始数据标准溶液未知液样品编号 1 2 3 4 5 6 x浓度/(mg∙L-1) 0 2 4 6 8 10荧光强度-0.029 0.230 0.462 0.675 0.916 1.122 0.774 2．标准曲线绘制和未知样品含量计算。
得到富里酸荧光强度与浓度的关系曲线为y=0.1147x-0.0106，测得未知液荧光强度为0.774，即0.774=0.1147x-0.0106得：x=6.84所以未知样品浓度为6.84mg∙L-1六实验注意事项1、试液的浓度不要太高。
荧光光度分析法
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浓度测定 1、如何进行校准和浓度测定 如何进行校准和浓度测定 按以下步骤，调整仪器，以便获取数据 第1步： 点击视图中的开始 开始(Stare)按扭，指向程序 开始 程序 (Program)→Cary Eclipse ， 然后选择扫描 扫描(Scan)即显示扫描功能框。 扫描 第2步： 点击设置 设置(Set up)，进入设置 设置(Set up)对话框， 设置 设置 指定检测方法的参数
荧光光度分析法
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一、基本原理
1.荧光的定义 1.荧光的定义 在紫外光或波长较短的可见光照射 后，一些物质会发射出比入射光波长更 --------荧光 荧光。 长的光 --------荧光。以测量荧光的强度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 分析法。 分析法。
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分子内的光物理过程
VR 2 1 v=0 S2 2 1 v=0 S1 ic VR isc
A1、A2. 吸收 、 F. 荧光 P. 磷光 ic. 内转化 isc. 体系间窜跃 VR. 振动松弛 VR 2 1 v=0 T1
ic A2 A1 F P
isc
3 2 1 v=0 S0
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3. 荧光强度与浓度的关系
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二、Varian Cary Eclipse 荧光 分光光度计的特点
1. 硬件及硬件的主要特点 ⑴ 高能闪烁光源-----氙灯 高能闪烁光源-----氙灯 由于荧光物质的荧光强度与 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预 耗能12 但脉冲输出能量却高达75 热、耗能12 W 但脉冲输出能量却高达75 KW 的闪烁氙 Xe） 并利用电子技术控制, 的闪烁氙（Xe）灯，并利用电子技术控制,使其 仅在发出测量指令后才闪烁。 仅在发出测量指令后才闪烁。这一设计给荧光 分析者带来极大的方便. 分析者带来极大的方便.
第八章 荧光分光光度法与检测技术
第八章 荧光分析法检测技术与应用
2. 用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2.00g食品，用 10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释 为10.0ml。维生素B2氯仿标准溶液浓度为0.100µg/ml。测得空白溶液、 标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F0=1.5，Fs=69.5，Fx=61.5， 求该食品中维生素B2的含量（μg/g）。
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
5. 下列叙述中，错误的是（ ）。 A、荧光分析的待测物应含有大π键 B、紫外分光光度法待测物应含有π键 C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低 6. 下列因素会导致荧光效率下降的有（ ）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
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第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
➢ 最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
➢强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
➢ 影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度法
荧光效率（φf）=
2、分子结构与荧光的关系 A 长的共轭结构 例 激发光 荧光 205nm 278nm 286nm 321nm 0.29 356nm 404nm 0.36
荧光效率 0.11
B 分子的刚性和共平面性
荧光效率：0.2
1.0
C 取代基：给电子基团使荧光效率增大，如 -OH、-OCH3、-NH2等。
表面吸 光物质
F
问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 单色器
I0
λex
I
表面吸 光物质
λem 单色器
检测器
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 强度F与激发波长之间的关系。
单色器 F荧光的产生
（1）振动弛豫：同一电子能级电子从高的 振动能级到最低的振动能级。
电子能级
原因：分子碰撞 结果：热能，无辐射
振动能级
（2）内部能量的转移
产生原因：受激分子常由高电子能级以无辐射 （热）跃迁方式转移至低电子能级。
电子能级 振动能级
（3）荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换 及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低 能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到 基态的任一能级。 第二激发态 第一激发态
散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定 有干扰，使其读数增大。
荧 光 光 谱
散 射 光 谱
不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 溶剂 水 248 271 313 350 365 416 405 469 436 511
乙醇
环已烷 四氯化 碳 氯仿
267
267 — —
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分析化学实验：荧光分光光度法测定硫酸奎宁含量
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• （二）硫酸奎宁荧光光谱的绘制 • 用10 mg/L的硫酸奎宁溶液作为测定液。 • 从380 nm到600 nm，每隔20 nm测定一次
荧光相对强度。以波长为横坐标，荧光相 对强度为纵坐标，在坐标纸上绘出荧光光 谱图，指出最大发射波长λmax为445 nm。
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（三）直接比较法测定测定硫酸奎宁含量
Cx
Fx Fs
Cs
式中：
CX——待测液的浓度； CS—标准液的浓度； FX—待测液的荧光强度 FS—标准液的荧光强度。
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定性依据： 激发光光谱 荧光光谱
定量依据：
当 l c≦0.05时,将括号项近似处理后：
F= 2.3 I0 l c = Kc
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定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，
绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样 的荧光强度，在标准曲线上求出浓度. 比较法：
实验二十八荧光分光光度法测定硫酸奎宁含量系间跨越3内转换振动弛豫内转换振动弛豫4500利用荧光分析方法测定能产生荧光的物质含量对不能产生荧光的物质可以利用某些具有能发生荧光基团的有机试剂与非荧光物质形成较纯的荧光化合物然后进行测定是一种高灵敏度的分析方法
实验二十八 荧光分光光度法测定硫酸奎宁含量
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在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度， 比较.
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荧光仪器组成： 激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
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三、实验内容
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第一章荧光分光光度分析法
1.1概述
1.1.1 基本原理
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。
物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态,这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。
不同物质由于分子结构的不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
1.1.2 基本结构
图1 荧光分光光度计工作原理示意图
（1）光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
（2）激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
（3）发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
（4）样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
（5）检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
可将光信号放大并转为电信号。
1.1.3 仪器操作规程
1.1.3.1 开机
a. 确认所测试样液体或固体，选择相应的附件。
b. 先开启仪器主机电源，预热半小时后启动电脑程序RF-5301PC，仪器自检通过后，即可正常使用。
1.1.3.2 测样
（1）spectrum模式
a. 在“Acquire Mode”中选择“Spectrum”模式。
•对于做荧光光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：“Spectrum Type”中选择Emission；给定EX波长；给定EM的扫描范围(最大范围220nm—900nm)；设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度，点击“OK”完成参数的设定。
•对于做激发光谱的样品，“Configure”中“Parameters”的参数设置如下：“Spectrum Type”中选择Excitation；给定EM波长；给定EX的扫描范围(最大范围220nm—900nm)；设定扫描速度；扫描间隔；狭缝宽度，点击“OK”，完成参数的设定。
b. 在样品池中放入待测的溶液，点击“Start”，即可开始扫描。
c. 扫描结束后，系统提示保存文件。
可在“Presentation”中选择“Graf” “Radar” “Both Axes Ctrl+R”来调整显示结果范围；在“Manipulate” 中选择“Peak Pick”来标出峰位，最后在“Channel”中进行通道设定。
d. 述操作步骤对固体样品同样适用。
（2）Quantitative模式
a. 在“Acquire Mode”中选择“Quantitative”模式。
b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下：
Method 选择“Multi Point Working Curve” ；“Order of Curve” 中选择“1st和
“No” ；给定EX、EM波长；设定狭缝宽度，点击“OK”，完成参数的设定。
c. 在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行“Auto Zero” 命令校零点。
d. 点击“Standard”模式，制作工作曲线。
e. 将样品池中的空白溶液换成一系列的已知浓度的样品标准溶液进行测量，执行“Read”命令，得到相应的荧光强度，系统根据测量值自动生成一条“荧光强度-浓度”曲线。
f. 在“Presentation” 中选择“Display Equation”，得到标准方程。
将此工作曲线“Save”为扩展名为“.std”的文件。
g. 工作曲线制备完毕，即可进入未知样的测量，选择进入“Unknown”模式，将样品池中的已知浓度标准溶液换成待测样品溶液，执行“Read”命令，即可得到相应的荧光强度和相应的浓度。
将此“Save”为扩展名为“.qnt”的文件。
（3）Time Course模式
a. 在“Acquire Mode”中选择“Time Course”模式。
b. “Configure”中“Parameters”的参数设置如下：
给定EX、EM波长；设定狭缝宽度；设定反应时间；读取速度；读取点数；
点击“OK”，完成参数的设定。
c. 在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行“Auto Zero” 命令校零点。
d. 将样品池中的空白溶液换成待测溶液，点击“Start”，即可开始扫描。
扫描结束后，即可得到荧光强度对时间的工作曲线。
e. 将此工作曲线“Save”为扩展名为“.TMC”的文件。
1.1.3.3 关机
退出软件后关毕主机。
1.2实验项目
实验1-1 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量（验证性实验）【目的要求】
1.学习荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。
2.掌握荧光光度计的操作技术。
【基本原理与技能】
维生素B2，又叫核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶。
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂。
在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2水溶液在430~440nm蓝光或紫外光照射下会发生绿色荧光，荧光峰在535nm，在pH 6~7的溶液中荧光强度最大，在pH 11的碱性溶液中荧光消失。
多维葡萄糖中含有维生素B1，B2，C，D2及葡萄糖均不干扰维生素B2的测定。
由于维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生光分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。
因此，测量维生素B2的荧光时，溶液要控制在酸性范围内，且须在避光条件下进行。
【仪器与试剂】
1.岛津RF-5301PC型荧光分光光度计；
2．10μg/mL维生素B2标准溶液：准确称取10.0mg维生素B2，用热蒸馏水溶解后，转入1L棕色容量瓶中，冷却后加蒸馏水至标线，摇匀，置于暗处保存；3．冰乙酸（AR）；
4．多维葡萄糖粉试样。
【操作步骤】
1.标准曲线的绘制
于6只50mL容量瓶中，分别加入10μg/mL维生素B2标准溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL，再各加入冰乙酸2.0mL，加水至标线，摇匀。
在970 CRT荧光分光光度计上，用1cm荧光比色皿于激发波长440nm，发射波长540nm 处，测量标准系列溶液的荧光强度。
2．多维葡萄糖粉中维生素B2的测定
准确称取0.15~0.2g多维葡萄糖粉试样，用少量水溶解后转入50mL容量瓶中，加冰乙酸2mL，摇匀。
在相同的测量条件下，测量其荧光强度。
平行测定三次。
【结果处理】
以相对荧光强度为纵坐标，维生素B2的质量为横坐标绘制标准曲线。
从标准曲线上查出待测试液中维生素B2的质量，并计算出多维葡萄糖粉试样中维生素B2的百分含量。
【注意事项】
1.请注意爱护液体比色皿，特别是测试有机样品的同学请在测量完毕后用有机溶剂清洗，干燥后再放入盒子中，否则会造成比色皿表面严重污染，影响透光度。
2. 固体样品池仅剩一个，测试完毕请物归原处。
3. 测试完毕请注意登记，关闭仪器。
【思考与讨论】
1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。
2. 维生素B2在pH=6~7时最强，本实验为何在酸性溶液中测定？
【思考与讨论的答案】
1. 答：由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高；而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。
2. 答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比维生素B2的荧光强的多。
因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。