12 分光光度分析法
分光光度法 定量限
分光光度法定量限分光光度法是化学分析中常用的一种定量分析方法，利用物质对特定波长的光的吸收特性进行定量测定。
该方法具有高灵敏度、高选择性、无干扰等优点，被广泛应用于药物分析、环境监测、农残检测等领域。
在分光光度法中，测量的主要原理是比较样品和标准溶液对特定波长的光的吸收情况。
光源通过单色仪选择出特定波长的光，光通过被测物质的溶液，被测物质吸收特定波长的光后，透射到光电探测器上，通过探测器测量光的透射率或吸光度，从而确定样品中的物质浓度。
在分光光度法的实验操作中，通常需要准备标准溶液和样品溶液。
标准溶液是已知浓度的溶液，用于校准光谱仪的读数和建立浓度与吸光度的关系。
样品溶液则是待测物质的溶液，需要在测量之前适当稀释以在测量范围内。
在测量过程中，还需要选择合适的波长、调节光谱仪的光谱分辨率，并进行基线校正，以排除背景的干扰。
在分光光度法中，用于定量分析的参考内容主要包括：1. 吸光度测量原理：介绍分光光度法的基本原理和测量过程，包括选择适当波长、建立标准曲线、计算样品浓度等内容。
2. 分光光度计的选择和使用：介绍不同类型的分光光度计的特点和适用范围，以及操作细节和注意事项，如如何正确校准仪器、选择合适的检测模式等。
3. 校准方法和标准溶液的制备：介绍校准的原理和方法，如如何制备标准溶液、准确称量、溶解和稀释等。
4. 方法验证和精密度评价：介绍如何验证分光光度法的准确性和可靠性，如确定方法的线性范围、精密度和准确度等指标。
5. 具体应用案例：以药物分析、环境监测、农残检测等领域为例，展示分光光度法在实际分析中的应用，如利用该法定量测定药物的含量、水中重金属离子的浓度等。
总之，分光光度法作为一种常用的定量分析方法，具有许多优点和广泛的应用领域。
掌握分光光度法的原理和操作要点，熟悉分光光度计的使用方法，具备制备标准溶液和验证方法的能力，将有助于准确和可靠地进行定量分析工作。
分光光度法基本原理简介
1.物质的颜色与吸收光的关系电磁波谱： X射线 0.1~100 nm远紫外光 10~200 nm近紫外光 200~400 nm可见光 400~760 nm近红外光 750~2500 nm中红外光 2500~5000 nm远红外光 5000~10000 nm微波 0.1~100 cm无线电波 1~1000 m2日光：紫蓝青绿黄橙红2014-11-33♥复合光：由各种单色光组成的光。
如白光(太阳光)♥单色光：只具有一种波长的光。
要求：∆λ=±2nm 。
♥互补色光：如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可以得到白光，这两种光就叫互补色光。
♥物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。
如：CuSO 4呈兰色。
♥物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。
光的互补：蓝 黄日光7♥ （1）不同物质吸收曲线的形状和吸收波长不同。
MnO 4-531吸收曲线2014-11-38♥（2）同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似。
♥吸收曲线是特性的，可以提供物质的结构信息，作为物质定性分析的依据之一；吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。
3.光的吸收定律——朗伯-比耳定律λ吸光度A：物质对光的吸收程度。
定义：A＝lg（I0/I t)A越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。
9λ1760年朗伯(Lambert)阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：A∝b•1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：A∝c二者的结合称为朗伯—比耳定律，A∝bc1011朗伯—比耳定律数学表达式：A ＝lg （I 0/I t )= εb c 式中：A ，吸光度，无量刚； b ，液层厚度(光程长度)，cm ； c ，溶液的浓度， mol · L -1 ； ε称为摩尔吸光系数，L·mol -１·cm -1，仅与入射光波长、溶液的性质及温度有关，与浓度无关。
分光光度分析法的基本原理
分光光度分析法的基本原理
分光光度分析法是一种常用于化学分析的技术，其基本原理是利用物质在特定波长的光照射下发生吸收或发射现象，通过测量被测物质对光的吸收或发射程度来确定其含量或性质。
在分光光度分析法中，首先使用光源发出连续光谱的光线，然后使用单色器将光线按波长进行选择。
选择的波长应为被测物质在该波长具有最大吸收或发射峰值的波长，以提高分析的准确性。
接下来，被测物质与光发生相互作用，其中一部分光被吸收，并转化为其他形式的能量，如化学反应产物的激发状态或电化学反应的电位变化。
另一部分光则不被吸收，保持原来的能量状态。
测量被测物质对光的吸收或发射程度时，一种常用的方式是使用光电二极管或光电倍增管来测量光的强度变化。
被测物质浓度或性质的变化将导致吸收或发射程度的变化，从而可通过测量光的强度来间接确定被测物质的含量或性质。
通过对标准溶液的测量，可以建立标准曲线，从而将测定的光强度值转化为被测物质的浓度或性质值。
分光光度分析法具有灵敏度高、精度高、选择性好等特点，广泛应用于环境监测、食品检测、药物分析等领域。
分光光度计与分光光度法
2.2.1 分光光度计的 光谱范围
包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围 为200～400 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的 发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的400～760nm 波长的光谱，光连续色谱；该色谱可作为可 见光分光光度计的光源。
3. 以7200可见光分光度计为例，讲解可见光分光度 计的正确使用方法
4. 以UV-754型紫外-可见分光光度计为例，讲解紫 外光光度计的正确使用方法
1. 分光光度法定义 与应用
1.1 定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴 别物质或测定其含量的分析检测技术。
1.2 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统 中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。
氢灯的发射光谱：氢灯能发出185～400 nm波长的 光谱，可作为紫外光光度计的光源。
谱（1）
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此 时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现 了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液 吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的 吸收光谱。
不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据吸收光 谱，可以鉴别溶液中所含的物质。
4、有色物稳定性高 其它离子干扰才小。如三
磺基水杨 酸铁的Kf =1042 , F- 、H3PO4 对它无干 扰。
5、显色过程易于控制 而且有色化合物与显
色剂之间的颜色差别应尽可能大。
| m MaRx m Rax | 60nm
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二、 显色反应条件的选择
1、显色剂用量 ，适当过量。
2、溶液酸度 既要防止被测离子生成沉淀，又需
第12章可见光分光光度法
厚度的乘积成正比.
即:
A = e bc
Lambert-Beer 定律不仅适用于有色溶液,也适用于其它均匀的、非散射用,则:
A 总 = A1 + A2 + …… = e1bc1 + e2bc2 + …… 吸光度具有加和性.
据: A=lg(1/T)= e bc,若 b 固定, A = K’c
显色剂 M(待测组分) → MR(有色化合物) 显色: 将待测组分转变为有色物质的过程. 显色剂: 使待测组分形成有色化合物的试剂. 1.显色反应分类: 氧化还原反应:
Ag+ 2Mn2+ + 5S2O82- + H2O → 2MnO4- + 10SO42- + 16H+ 配位反应: 多数显色反应以配位反应为主. 2.显色反应的选择: (1)灵敏度与选择性:含量低、干扰少时一般选择高灵敏度(e max > 6×104) 的显色反应; 含量较高、选择性较差,且难以消除时选择中、低灵敏度(e max < 5×104 )的显色反应. 显色反应的选择性: 一定条件下显色反应的专一性. (2)显色剂的吸收以及有色物质的稳定性: 在测定波长处尽量无吸收,或对比度尽可能大 对比度 Δl = ½lmaxMR- lmaxR½≥ 60nm MR 应足够稳定. 3.显色反应条件的选择: 酸度;
e = A/bc = 1.20/(2.0 ´ 5.37 ´ 10-5) = 1.1 ´ 10-4 L·mol-1·cm-1.
3.摩尔吸光系数的意义:
定性与结构分析的参数;
同一吸光组分,不同 l 或不同溶剂中, e 不同;
不同吸光组分,一定 l 和确定的溶剂中,e 也 不相同.
估量定量方法的灵敏度.
分光光度法的基本原理
分光光度法的基本原理
分光光度法是一种常用于分析、确定物质浓度的方法。
其基本原理是将待测物质溶液通过一束光束，然后通过光学系统使光束分成两部分，分别通过样品液和对照液，最终两束光束再重合形成一个荧光强度差。
待测物质会对入射光束进行吸收，导致出射光束的强度减弱，而对照液不会对光束产生吸收作用，出射光束强度不变。
通过测量两束光的强度差异，可以推断待测物质的浓度。
分光光度法使用光栅或棱镜使入射光束通过色散，然后通过滤光片选择特定波长的光，再通过样品液和对照液后，出射光会被光电池或光电二极管接收，转化为电信号。
根据输出的电信号强度，可以计算出待测物质的浓度。
分光光度法的优点是测量精度高、灵敏度高、操作简便。
它可以在高浓度样品中进行测量，可以使用各种波长的光来进行分析。
然而，它也存在一些限制，例如对色散（波长漂移）的影响比较大，需要定期校准光谱仪器。
此外，分光光度法对于有色物质的测量更准确，对于无色物质的测量精度较低。
第十二章-分光光度分析法
第十二章分光光度分析法（一）判断题1. 可见光的波长范围在400-760nm之间。
（）2. 吸光度A与透光度T成反比。
（）3. 朗伯-比尔定律只适用于单色光。
（）4. 同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时具有相同的ε值。
（）5. 可见光源用钨丝白炽灯，紫外光源用氘灯。
（）6. 若显色剂用量多，则显色反应完成程度高，故显色剂用量越多越好。
（）7. 一般来说，加入有机溶剂，可以提高显色反应的灵敏度。
（）8. 浓度相对误差仅与仪器读数误差相关。
（）9. 浓度较高时测量相对误差大，浓度较低时，测量相对误差小。
（）10. 符合朗伯-比尔定律的某有色溶液稀释时，其最大吸收波长λmax向长波方向移动。
（）11. 有色溶液的吸光度随溶液浓度增大而增大，所以吸光度与浓度成正比。
（）12. 在光度分析中，溶液浓度越大，吸光度越大，测量结果越准确。
（）（二）填空题1. 朗伯-比尔定律数学表达式：A=kbc，式中A代表，b代表，c代表，k代表。
当c 的单位用mol·L-1表示时，k以符号表示，称为。
2. 下列物质水溶液选择吸收光的颜色为：CuSO4；K2Cr2O7； KMnO4。
3. 光度计的种类和型号繁多，但都主要由、、、、五大部件组成。
4. 分光光度计的表头上，均匀的标尺是，不均匀的标尺是。
5. 为了降低测量误差，吸光光度分析中比较适宜的吸光度范围是，吸光度为时，测量误差最小。
6. 在以参比溶液调节仪器的零点时，因无法调至透光度为100%，而只好调节至95%处，此处测得一有色溶液的透光度读数为35.2%，该有色溶液的真正透光度为。
7. 二苯硫腙的CCl4溶液吸收580 ~ 620nm范围内的光，它显色。
8. 测量某有色配合物在一定波长下用2cm比色皿测定时其T=0.60，若在相同条件下改用1.0cm比色皿测定，吸光度A为，用3.0cm比色皿测定，T为。
9. 苯酚在水溶液中摩尔吸光系数为6.17⨯103L·cm—1·mol—1，若要求使用1.0cm比色皿，透光度在0.15 ~0.65之间，则苯酚的浓度应控制在。
紫外可见分光光度法测定维生素B12含量
紫外可见分光光度法测定维生素B12含量作者:作者：靳月琴郭丽敏宋建荣杨金香刘海林陈文斌作者单位：长治医学院化学综合实验室(046000)【摘要】目的：探讨维生素B12片剂中维生素B12的含量测定方法。
方法：紫外可见分光光度法。
样品以标准曲线法为测定含量依据，在361 nm的波长处测定吸光度。
结果：维生素B12在5 μg/mL～100 μg/mL浓度范围线性关系良好。
回归方程Y=0.0193X+0.048,r=0.9937。
结论：测定的5个不同批号样品其含量均在标示范围之内,该方法简便、准确、灵敏度高。
【关键词】紫外可见分光光度法；维生素B12片剂；含量测定The Content Measurement of V-B12 by UV-VisJin Yueqin,Guo Limin，Shong Jianrong,et al.Department of Chemistry Complex Laboratory of Changzhi Medical CollegeAbstract Objective：The measurement method of V-B12 content in tablet is established.Methods：UV-Vis The absorption is measured at 361 nm according to calibration carve method.Results：The linear range is in 5 μg/mL～100 μg/mL and the regression equation is Y=0.0193X+0.048,r=0.9937.Conclusion：The measurement is done in 5 kind of lot number and the result indicate that the V-B12 content in tablet corresponds with standard range. This method is simple, accurate and high sensitivity.Key words UV-Vis；V-B12 tablet；Content measurement维生素B12是含钴的有机药物，为深红色结晶，又称为红色维生素B12或氰钴胺，是唯一含有主要矿物质的维生素。
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这一规律称吸光度的加和性。
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12.2.2 摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 * 摩尔吸收系数 当浓度c用mol·-1，液层厚度b用cm为单位表示，则K L 用另一符号ε来表示。ε称为摩尔吸收系数，单位为 L· -l· -1，它表示物质的量浓度为l mol·-1，液层厚 mol cm L 度为l cm时溶液的吸光度。
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（3）由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物 或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗 伯—比尔定律。
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12.3 光度分析的方法和仪器 12.3.1 目视比色法 用眼睛观察、从管口垂直向下观察（比色管），比较待 测溶液和标准溶液颜色的深浅，以确定物质含量的方法。 优点是仪器简单，操作简便，适宜于大批试样的分析。 灵敏度高，因为是在复合光-白光下进行测定，故某些显 色反应不符合朗伯-比尔定律时，仍可用该法进行测定。 主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测 定时临时配制。
I0 Ia It Ir
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在分光光度分析法中，试液和空白溶液分别臵于同样质 料及厚度的吸收池中，然后让强度为I0的单色光分别通过 这两个吸收池，再测量其透过光的强度。此时反射光强 度基本上是不变的，且其影响可以相互抵消。 透光度或透光率 透过光强度It与入射光强度Io之比称为透光度或透光率， 用T表示溶液的透光度愈大，表示它对光的吸收愈小;相 反，透光度愈小，表示它对光的吸收愈大。
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（2）介质不均匀引起的偏离 朗伯－比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的。如果被 测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光 通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射 现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，便标 准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。故在光度法中应避免溶 液产生胶体或混浊。
2 波长与颜色的关系
物质颜色
黄 绿 黄 橙 红 紫 红 紫 蓝 绿 蓝 蓝 绿 吸 颜 色 紫 蓝 绿 蓝 蓝 绿 绿 黄 绿 黄 橙 红 收 光 波长范围λ /nm 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-600 600-650 650-750
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在可见光，KMnO4溶液对 波长525 nm附近绿色光的吸 收最强，而对紫色和红色的 吸收很弱。λmax=525 nm。 浓度不同时，光吸收曲线 形状相同，λmax不变，吸光 度不同。
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A lg Io I Kbc
A lg Io I lg 1 T
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朗伯-比尔定律表明：当一束单色光通过含有吸光物质的 溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正 比。这是进行定量分析的理论基础。 比例常数K与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素 有关。 含有多种吸光物质的溶液，如果各吸光物质对某一波长的 单色光均有吸收作用，且各吸光物质的吸光质点之间相互不 发生化学反应，则：
1 2
1
A A bc 1 bc 2
1 2 1 2
1 1 1 1
1 2
2
A A bc 1 bc 2
1 2 1 2
2 2 2 2
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12.3.4 分光光度计及其基本部件 分光光度计按工作波长范围分类，紫外、可见分光 光度计应用于无机物和有机物含量的测定，红外分光 光度计主要用于结构分析。分光光度计又可分为单光 束和双光束两类。722型分光光度计是数字显示的单光 束、可见分光光度计。 分光光度计的基本部件:光源、单色器、比色皿、检 测器和显示装臵。
cb : ? mol / 1000 cm
cb 1000
cb 0 . 001
2
M 10
6
cbM 10 (? g / cm ) S
3 2
S cbM 10
3
0 . 001
M 10
3
M
( g / cm )
2
桑德尔灵敏度越小，表示显色反应越灵敏。
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12.1.3 溶液的颜色与光吸收的关系
光是一种电磁波。根据波长或频率排列，得到如表的电磁 波谱表。
表 电磁波谱范围表
光谱名称 x射 线 远紫外光 近紫外光 可 见光 近红外光 中红外光 远红外光 微 波 无线电波 波长范围 -1 10 ～l0nm 10～200nm 200～400nm 400～750nm 0.75～2.5μ m 2.5～5.0μ m 5.0～1000μ m 0.1～100cm 1～1000m 跃迁类型 辐 射 源 K 和 L 层电子 x 射线管 中层电子 氢、氘、氙灯 价电子 氢、氘、氙灯 价电子 钨灯 分子振动 碳化硅热棒 分子振动 碳化硅热棒 分子转动和振动 碳化硅热棒 分子转动 电磁波发生器 分析方法 x 射线光谱法 真空紫外光度法 紫外光度法 比色及可见光度法 近红外光度法 中红外光度法 远红外光度法 微波光谱法 核磁共振光谱法
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光源
单色器
样品池
显示装置
检测器
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*光源 光源的作用是提供辐射--连续复合光 可见光区 钨灯 320-2500nm 优点：发射强度大、使用寿命长 紫外光区 氢灯或氘灯 180-375nm 氘灯的发射强度比氢灯大4倍 玻璃对这一波长有强吸收，必须用石英光窗。 紫外-可见分光光度计同时具有可见和紫外两种光源。
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1 相关概念 *吸收光谱：原子吸收光谱 和分子吸收光谱。是因物 质对不同波长的光具有选 择性吸收作用而产生的。 * 单色光：具同一波长的光。 * 复合光：由不同波长组成 的光。*
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A bc
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例 浓度为25.5μg/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草 酰二腙光度法测定，在波长600nm处用2cm比色皿测量 A=0.297，计算摩尔吸光系数。 解：
[ Cu
2
]
25 . 5 10 50 10
3
6
63 . 55 2
8 . 0 10
4
6
mol . L
1
1
A bc
0 . 297 8 . 0 10
6
1 . 9 10 L .mol
.cm
1
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* 桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数) S 指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内 所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg· cm 2，S与ε及吸光物质摩尔质量M的关系为：
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* 吸收光谱曲线或光吸收曲线： 以波长为横坐标，吸光度 为纵坐标作图。 * 最大吸收波长：光吸收程度 最 大 充 处 的 波 长 ， 用 λmax 表示。 * 吸光度A(也称消光度E或光 密度D)：溶液对光的吸收 程度。
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较平坦
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* 克服非单色光引起的偏离的措施 ◎ 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光”， 使标准曲线有较宽的线性范围。 ◎ 入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较 高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波 长附近各波长的光的ε值大体相等，由于非单色光引起的 偏离要比在其他波长处小得多。 ◎ 测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线 的线性范围内。
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12.3.2 标准曲线法 借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制 标准曲线，根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被 测物质的浓度或含量。
特点：入射光是纯度较高的单色光，故使偏离朗伯-比 尔定律的情况大为减少，标准曲线直线部分的范围更大， 分析结果的准确度较高。
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不平坦
（1）非单色光引起的偏离 * 朗伯-比尔定律只适用于单色光， 但由于单色器色散能力的限制和 出口狭缝需要保持一定的宽度， 所以目前各种分光光度计得到的 入射光实际上都是具有某一波段 的复合光。由于物质对不同波长 光的吸收程度的不同，因而导致 对朗伯－比尔定律的偏离。
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