第八章荧光分光光度法与检测技术。
荧光分光光度计使用操作注意事项 光度计操作规程
荧光分光光度计使用操作注意事项光度计操作规程荧光分光光度计也被称作（荧光光谱仪），是一款利用惰性气体氩气作载气，将气态氢化物和过量氢气与载气混合后，导入加热的原子装扮置。
原子荧光光谱分析法具有设备简单、灵敏度高、光谱干扰少、工作曲线线性范围宽、可以进行多元素测定等优点。
在地质、冶金、石油、生物医学、地球化学、材料和环境科学等各个领域内获得了广泛的应用。
作为一款专业测量分析物质的设备，为避开荧光光谱仪在使用过程中显现分析误差，需要注意以下几点：1.在打开荧光光谱仪的主机之前，需要调整其设备各性能数值，比如需要先开氩气钢瓶总阀并将出口压力调至规范区域内，否则会导致仪器欠压报警并对荧光光谱仪的正常工作造成影响。
2.需要安装需测的元素灯，再打开仪器，开启设备后等仪器自检结束，再检查看元素灯有没有亮，然后取下排风罩，将调光器放在原子化器上，旋转元素灯座的可调螺钉，调整元素灯光斑中心至对光器横线与竖线的交叉点，便完成对元素灯的安装调整。
3.在使用荧光光谱仪的过程中应保持试验室通风情形良好，并对废液桶进行适时处理，以保持废液排放正常。
4.在荧光光谱仪完成测试后，需要对其进行适时清理，避开因残留异物导致下次检测显现错误。
5.在对荧光光谱仪清洁完后，依照规定操作对各开关进行关闭，并进行相应的存放操作。
6.定期对荧光光谱仪进行检修保养，适时清洁荧光光谱仪中的异物，避开其对设备造成损坏。
由于资料有限，因而上述（荧光光谱仪）操作注意事项并不全面，在实际进行操作的过程中，建议咨询相关专业技术人员，并查阅相应使用说明书。
原子吸取分光光度计有效的样品处理技术原子吸取分光光度计样品要被吸喷雾化后才能被分析，为了使测量的结果有代表性，必需要保证样品均匀的分布在溶液中。
所以有很多样品必需要经过前处理才能拿来测定，而不同的样品有不同的前处理方法，同一样品也有多种的前处理方法，选择不同方法的依据就是便利快捷、同时又要尽量削减样品的用量，削减有效成分的流失。
荧光分光光度法的原理
荧光分光光度法的原理荧光分光光度法是一种常用的分析技术，主要用于测定物质中的荧光发射强度。
它基于荧光物质吸收能量后发生激发态转变的原理，通过测量样品在不同波长下发射的荧光强度来分析物质的成分和浓度。
荧光分光光度法的原理基于荧光现象，即物质在吸收辐射能量后，会从基态跃迁到激发态，然后再发射出荧光。
这种荧光发射的波长和强度与物质的结构和环境有关，因此可以通过测量荧光的特性来获得样品的信息。
荧光分光光度法的基本装置包括激发源、选择性的滤光片或光栅、样品池和荧光检测器。
激发源通常使用紫外光或可见光，其波长可以根据待测样品的特性进行选择。
滤光片或光栅用于选择特定的波长范围，以便测量样品在该波长下的荧光强度。
样品池用于容纳待测样品，并通过光路使激发光和荧光光进入检测器进行测量。
在进行荧光分光光度测量时，首先需要选择适当的激发光源和荧光检测器，以及调节合适的滤光片或光栅。
然后将待测样品放入样品池中，使其与激发光发生作用。
样品吸收激发光后，发生激发态转变，并发射出荧光。
荧光光通过滤光片或光栅进行选择性筛选，然后进入荧光检测器进行测量。
荧光分光光度法的应用十分广泛。
在生物医学领域，它常用于荧光染料的检测和荧光标记的分析。
在环境监测中，荧光分光光度法可以用来检测水中的有机物污染物。
此外，荧光分光光度法还可以用于食品检测、药物分析、环境污染监测等领域。
荧光分光光度法相比于其他分析技术具有许多优点。
首先，它具有极高的灵敏度，可以检测到很低浓度的物质。
其次，荧光分光光度法对样品的破坏较小，可以进行非破坏性分析。
此外，荧光分光光度法还具有选择性和快速性的特点，可以同时测定多个物质。
然而，荧光分光光度法也存在一些局限性。
首先，荧光分光光度法对样品的环境要求较高，如温度、pH值等因素都会影响荧光强度。
其次，荧光分光光度法在样品有强荧光背景的情况下，可能会受到干扰。
此外，荧光分光光度法对荧光物质的选择性较差，容易受到其他物质的影响。
荧光光谱检测技术
荧光光谱技术是一种重要的光电检测技术，具有许多独特优势，选题合理。
请尽快确定课题完成方式，完善相关技术路线，开展课题调研论证工作。
80荧光光谱检测技术荧光光谱技术是一种重要的光电检测技术，特别是在物质种类检测中有着重要的应用。
它是对辐射能激发出的辐射强度进行定量分析的发射光谱分析方法。
物体经过叫短波长的光照射后辐射出较长波长的光，这种光就是荧光，最常见的日光灯的发光原理就是物质吸收较短波长的光（紫外光）能量辐射出较长波长的光（可将光）的现象。
一、荧光光谱检测技术原理通常条件下，分子处于单重态的基态。
分子受到紫外至红外激励的光子入射作用后，分子得到受激而引起电子能级的跃迁或振动和转动能级的跃迁，分子受激后，处于电子激发的单重态的某种振动激发态( v ≠0)的分子(见图1)或通过内部转换(Internal Conversion)和振动弛豫(Vibrational Relaxation)的非辐射，相继发hv；或通过激发单重态S1和激发三重射荧光光子，回到电子基态得到荧光光谱f态T1间的系间窜越(Intersystem Crossing)和振动弛豫至T1 ( v =0)，放出能量回到hv。
基态S0( v =0,1)得到荧光光谱的光子r图1 光致发光系统部分每一种物质的分子或原子结构是独一无二的，原子能级图也就有不同的分布，原子能级跃迁也就会辐射出不同频率的电磁波，就好比是人的指纹；每一种物质的荧光效应都有其特定的吸收光的波长和发射的荧光波。
利用这一特性，可以定性鉴别物质。
研究分子的荧光光谱可为研究分子的微观结构、分子的构象特点及变换情况提供帮助。
任何发荧光的分子都具有两个特征光谱:荧光激发光谱(Excitation Spectrum)和荧光发射光谱(Emission Spectrum)。
它们是荧光分析法进行定性和定量分析的基本参数和依据，也是荧光光谱稳态分析中的两个基本特征。
二、荧光光谱检测技术的特点1.灵敏度高荧光光谱检测分析有着极高的灵敏度。
第八章 荧光分光光度法与检测技术
第八章 荧光分析法检测技术与应用
2. 用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2.00g食品，用 10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释 为10.0ml。维生素B2氯仿标准溶液浓度为0.100µg/ml。测得空白溶液、 标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F0=1.5，Fs=69.5，Fx=61.5， 求该食品中维生素B2的含量（μg/g）。
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
5. 下列叙述中，错误的是（ ）。 A、荧光分析的待测物应含有大π键 B、紫外分光光度法待测物应含有π键 C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低 6. 下列因素会导致荧光效率下降的有（ ）。 A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
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第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
➢ 最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
➢强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
➢ 影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
荧光分析法实验报告
荧光分光光度法一、实验目的1、学习荧光分光光度法的基本原理；2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法；3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。
二、实验原理荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。
荧光（fluorescence）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。
由此可见，荧光是一种光致发光。
任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和发射光谱（emission spectrum）或称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。
绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。
荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。
绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。
激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。
荧光强度（F）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即FKc该式即荧光分光光度法定量分析的依据。
使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。
三、仪器与试剂F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL）；牛血清白蛋白（BSA）四、实验内容1、开机准备：接通电源，启动电脑。
打开光谱仪主机电源，预热15分钟。
2、运行FL solution软件，设定检测方法和测量参数：EX（激发波长）：280nmEM（发射波长）：340nmEX扫描范围：210nm～330nmEM扫描范围：290nm～450nmEX缝宽：2.5nm，EM缝宽：2.5nm扫描速度：240nm/minPMT电压：700V3、激发光谱和发射光谱的绘制：先固定激发波长为280nm，在290～450nm测定荧光强度，获得溶液的发射光谱，在343nm附近为最大发射波长λem；再固定发射波长为λem，测定激发波长为200nm～λem 时的荧光强度，获得溶液的激发光谱，在280nm附近为最大激发波长λex。
分子荧光分光光度法实验技术
标准样品设置
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待测样品设置
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空白校零
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开始测定
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重新计算
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九、荧光光度计使用注意事项：
1、比色皿使用之前应清洗干净。若比色皿很脏， 清洗方法为：先将比色皿置于铬酸洗液中浸泡半 小时左右，再用蒸馏水洗净，凉干留用。
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一、荧光分析法
物质的基态分子受一激发光源的照 射，被激发至激发态后，在返回基态时， 发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。 若物质分子用X射线或红外光激发，则分 别产生X射线荧光或外光荧光。
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一、荧光分析法
通常所指的分子荧光是指紫外-可见光 荧光，即利用某些物质受到紫外光照射后， 发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的 紫外荧光或可见荧光，通过测定物质分子 产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光 分析。
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七、荧光分光度计的性能
可检测荧光、磷光及生物发光 扫描速度快，可达24000 nm/分，数据采
集速率达80次/秒 波长范围：190-1100 nm 光谱带宽：1.5、2.5、5、10和20 nm五档
切换 具有液体池和固体池，并具有自动控温设备。
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5、罩上仪器罩，打扫室内卫生，并在仪器使用登 记本上填写使用记录。
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操作软件包
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定性分析操作
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预扫描
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荧光分光光度法测定药液维生素B2的含量
仪器部件
a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度 计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。
b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定 量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可 获得激发光谱和荧光光谱。
c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光 光度计采用光电倍增管作检测器。
药液维生素B2含量的测定
维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结 晶，其结构式为：
维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸 性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。
维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色 荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强， 在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生 分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，
c. 所需试样量少、操作方法简便。
激发光谱
荧光光谱
激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与
照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，
荧光强度最大。
发射光谱
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与 发射光波长关系曲线。
固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定 激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长 和发射荧光波长的选择是本实验的关键。
在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：
I F 2.303I0bc
当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：
I F Kc 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
荧光分析法的特点
a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更 高的灵敏度。
荧光分光光度法
荧光分光光度计的结构与操作
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荧光分光光度计的结构
荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测 器等部分组成，各部分协同工作完成荧光光谱的 测量。
荧光分光光度计的操作步骤
操作步骤包括样品准备、仪器调试、参数设置、 数据采集与分析等，操作时应严格按照仪器说明 书进行。
荧光分光光度计的维护与保养
为了保持仪器的性能和延长使用寿命，应定期对 仪器进行维护和保养，如清洁光学元件、检查电 路连接等。
荧光分光光度法
目录
CONTENTS
• 荧光分光光度法简介 • 荧光分光光度法的基本原理 • 荧光分光光度法的实验技术 • 荧光分光光度法的应用实例 • 荧光分光光度法的挑战与展望
01 荧光分光光度法简介
CHAPTER
定义与原理
定义
荧光分光光度法是一种基于荧光物质与激发光的相互作用， 通过测量荧光光谱来研究荧光物质性质的分析方法。
利用荧光染料标记DNA或RNA，通过 荧光光谱法检测基因表达和突变，以 及DNA和RNA的定量分析。
在环境监测领域的应用
污染物检测
荧光分光光度法可用于检测水体、土壤和空气中的有 害物质，如重金属、农药、酚类化合物等。
饮用水安全
通过荧光光谱法检测饮用水中的消毒副产物，确保饮 用水安全。
生态毒理学研究
荧光光谱的定量分析方法
荧光光谱的定量分析原理
荧光光谱的定量分析基于荧光物质浓度与荧 光强度之间的线性关系，通过测量荧光强度 可以推算出荧光物质的浓度。
荧光光谱的定量分析方法
定量分析方法包括标准曲线法、内标法、外标法等 ，应根据实验需求选择合适的分析方法。
荧光光谱的定量分析误差 来源
误差来源包括仪器误差、样品不均匀性、操 作误差等，应采取相应措施减小误差，提高 分析精度。
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最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
第一节 荧光分光光度法的基本原理
某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比 吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这 种发射光称为荧光（fluorescence）。
荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧 光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又 称荧光光谱法
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第一节 基本原理
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第一节 基本原理
（二）荧光分光光度计的基本结构
1.光源 2. 4. 7. 9. 狭缝 3. 激发单色器 5. 样品池 6. 表面吸光物质 8. 发射单色器 10. 检测器 11. 放大器 12. 指示器 13. 记录器
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第一节 基本原理
光源 目前最常用的是氙灯 单色器（分光系统） 激发单色器 发射单色器 样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英 检测器 光电倍增管
F = K′（I0 – I）
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第二节 荧光定量分析
K′为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条 件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：
F = 2.303·φF·I0·ε·c·L
入射光强度I0在波长一定，光源稳定时为固定 值，因此可以将2.303·φF·I0·ε·L视为常数K，故：
F = Kc
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Fs F0 cs Fx F0 cx
cx
Fx Fs
F0 F0
cs
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第二节 荧光定量分析
多组分混合物测定 与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需
经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物 质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同 荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外可见分光光度法广泛。
二、定量分析方法 标准曲线法
配制一系列浓度为c1、c2、c3……对照品溶液， 分别测其F1、F2、F3……值，用F~c作图绘制标准曲
线。 然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准
曲线上查找对应的浓度cx。
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第二节 荧光定量分析
比例法 若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围
用比例法测定。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强 度（Fs），再测定试样溶液（cx）的荧光强度（Fx）， 然后进行比较。测定时同样要以空白（F0）校正：
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第一节 基本原理
任何荧光物质都具有两个特征光谱：
激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光 波长而变化的关系曲线（以激发光波长λex为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。
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第一节 基本原理
荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质
所产生的荧光通过发射分光系统 ( II )分光，测定每 一发射波长荧光强度F，以发射光波长λem为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。
7
第一节 基本原理
三、荧光与分子结构
（一）荧光物质的特征 具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收 具有高的荧光效率
发射荧光的量子数
荧光效率 F 吸收激发光的量子数
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第一节 基本原理
（二）分子结构与荧光的关系
大的共轭π键结构
λex（激发） λem（激发）
φF
苯
205
278
0.11
（四）荧光分光光度计
荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出 的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发 射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏 振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和 结构情况。
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第一节 基本原理
（一）仪器类型
滤光片荧光计 滤光片-单色器荧光计 荧光分光光度计
一、荧光的产生过程 （一）单重态与三重态 A 单重基态 B 激发单重态 C 激发三重态
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第一节 基本原理
（二）荧光的产生 电子由激发单重态 →基态单重态的跃 迁
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第一节 基本原理
（二）磷光的产生 电子由激发三重态→基态单重态的跃迁
课堂互动 您能比较荧光和磷光的主要区别吗？
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第一节 基本原理
二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
第二节 荧光定量分析
当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的 荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的 依据。
但只有当荧光物质的浓度很小时， 即ε·c·L ≤ 0.05，这种关系才成立。
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第二节 荧光定量分析
课堂互动
请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度 比紫外-可见分光光度法要高？
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第二节 荧光定量分析
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第一节 基本原理
（三）仪器校准 灵敏度校准 波长校准 激发光谱和发射光谱校准
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第一节 基本原理
课堂互动 请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光 光度计的主要区别
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第一节 基本原理
点滴积累
荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射 时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
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第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
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第二节 荧光定量分析
点滴积累
当其他条件（即φF、I0、ε、L）一定时，荧光物质在 稀溶液中的荧光强度F与浓度c成正比。
荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同。
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第三节 应用与发展
萘
286
321
0.29
蒽
365
400
0.46
四苯
390
480
0.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ0
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第一节 基本原理
分子的刚性和共平面性
联苯φF =0.18
取代基的影响
芴F=1.0
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第一节 基本原理
（三）影响荧光强度的外界因素
温度 溶剂 溶液酸碱性 荧光熄灭剂 散射光 激发光源
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第一节 基本原理