层析基本原理及工艺的建立
层析技术
吸附柱层析
一、常用术语
5.洗脱体积（Ve）： 是指某一成分从柱顶部到 底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。 6.分配系数和迁移率：分配系数是指一组分在流动相 与固定相中含量的比值，常用K表示。而迁移率是指 一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相 移动距离之比，常用Rf表示。其差异越大，分离效果 越好。
高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低 的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机 物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量 大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析。
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲 和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效 液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余 地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对 组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作 用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数， 这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和 力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组 分阻滞作用的不同。
（3）按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向 移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动 相展开，以达到分离鉴定的目的。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸 层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
固定相也有两种状态：
*液体作为流动相
*固体吸附剂作为固定相
*气体作为流动相
*以吸附在固体上的液体 作为固定相
按两相所处的状态分为：
液相色谱 液-固层析
液-液层析
气相色谱 气-固层析
层析技术电泳技术
⑤亲和层析
亲和层析是利用待分离的生物大分 子和它的特异性配体间具有的特异亲和 力，使之与杂质成分分离的一类特殊层 析技术。
具有专一亲和力的“生物分子对”主要有： 抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受 体；RNA和其互补的DNA、糖蛋白-植物凝集素等。
磺酸基（强酸型） 羧基、酚羟基（弱酸型） 阴树脂引入碱性基团（带正电荷） 季铵基（强碱型） 氨基、仲胺基、叔胺基（弱碱型）
层析的基本原理： 各组分有性质差异——分配系数 不同——在层析系统中移动速度 不同——由此而分离。
各组分的性质差异包括理化性质及生 物学性质：（如溶解度、吸附力、分 子形状及大小、立体化学性质、荷电 特性、特异的生物学亲和力等）
层析法是通过分离而实现分析。 既可以定性分析，也可以定量分析。
根据层析峰的位置及峰高或峰面 积，可以定性及定量。
③离子交换层析
以离子交换剂为固定相，根据物质的 带电性质及带电量不同而与固定相的静电 作用力差异，以电解质溶液为流动相，通 过离子置换实现对目标物质的分离。
④凝胶过滤层析
以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相， 根据筛分原理（反筛），利用物质的分子大 小差异进行分离的技术。也叫分子筛层析、 排阻层析。
◈保留时间(retention time，tR) 从进样开始到某个组分在柱后出现
浓度最大值的时间。
◈保留体积(retention volume，VR) 从进样开始到某组分在柱后出现浓
度最大值时流出溶剂的体积。又称洗脱 体积。
◈死时间
不被固定相滞留的组分，从进样至出 现浓度最大值时所需的时间称为死时间 (dead time，tM ) 。 ◈死体积
层析技术简介
第八章层析分离技术生物分离过程的一般流程层析技术(chromatography)又称色谱法，俄国植物学家Michael Tswett于1906年首先创建1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物1941年Martin 和Synge发现了液－液（分配）色谱[liquid-lipuid (partition)chromatography,LLC]第一节层析技术概述一、层析的基本原理（一）基本原理层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。
优点：（l）分离效率高。
（2）应用范围广。
（3）选择性强。
（4）设备简单，操作方便。
缺点：处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室，工业生产上还应用较少。
（三）层析的基本概念1.固定相2.流动相3.分配系数及迁移率（或比移值）4.分辨率（或分离度）5.正相色谱与反相色谱6.操作容量（或交换容量）二、层析分离技术的分类1.吸附层析2.分配层析3.凝胶过滤（分子筛）4.离子交换层析5.亲和层析三、柱层析基本操作技术1.装柱2.平衡3.加样4.洗脱5.流速控制6.分部收集7.洗脱峰检测、合并收集8.层析介质的再生第二节吸附层析(absorption chromatography)一、吸附层析的原理与特点吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表面，而从混合物中的分离的的过程。
典型的吸附过程包括四个步骤：吸附的类型（1）物理吸附: 放热，可逆，单分子层或多分子层，选择性差（2）化学吸附: 放热量大，单分子，选择性强（3）交换吸附: 吸附剂吸附后同时放出等当量的离子到溶液中吸附法特点（1）不用或少用有机溶剂（2）操作简便、安全、设备简单（3）生产过程pH 变化小（4）从稀溶液分离溶质（5）吸附剂对溶质的作用小（6）吸附平衡为非线性（7）选择性较差吸附法的应用气体过滤水处理脱色、除臭目标产物的分离二、吸附剂（固定相）的选择吸附剂通常应具备以下特征：▪表面积大、颗粒均匀、▪对被分离的物质具有较强的吸附能力▪有较高的吸附选择性▪再生容易、性能稳定▪价格低廉。
五种层析方法和原理
五种层析方法和原理五种层析方法和原理1. 列点 1•新华字典定义：层析方法是一种通过分析物质内部不同成分在不同条件下的分布情况，从而推断物质组成、性质和结构的方法。
•原理：层析方法基于物质成分在固定相和流动相之间的分配行为。
固定相通常是固体或涂覆在固体上的物质，而流动相则是向上或向下流动的溶剂。
2. 列点 2•薄层层析法：–原理：薄层层析法是一种将样品溶解在溶剂中后涂覆在薄层板的表面上，然后通过毛细作用将溶剂上升至薄层表面，样品成分分离的方法。
根据样品成分的亲疏水性质和与固定相的相互作用，不同成分会以不同的速度在薄层板上移动，从而实现分离。
–应用：薄层层析法常用于化学品分析、食品检测和药物分析等领域。
3. 列点 3•气相层析法：–原理：气相层析法是利用气体（流动相）和涂覆在固体或涂覆在固体上的涂层（固定相）之间的分配作用，使样品成分在涂层上分离的方法。
样品经过蒸发后进入气化室，在高温和惰性气体的作用下，样品成分分解为气体状态，然后进入色谱柱，通过不同成分与固定相的相互作用，实现分离。
–应用：气相层析法广泛应用于环境监测、食品安全检测和生物医药领域。
4. 列点 4•液相层析法：–原理：液相层析法是通过溶液中样品成分与固定相之间的相互作用，实现样品分离的方法。
当溶液通过柱子时，样品成分会根据其与固定相的相互作用力的强度和性质不同，在固定相上停留的时间也不同，从而实现分离。
–应用：液相层析法广泛应用于药物分析、食品检测和环境监测等领域。
5. 列点 5•离子交换层析法：–原理：离子交换层析法利用带电粒子（离子）之间的静电相互作用，在一定条件下，使样品中的离子与固定相中的带电粒子发生相互作用，从而实现分离。
不同离子会在不同条件下被吸附或释放，从而实现分离。
–应用：离子交换层析法常用于水质分析、药物分析和环境监测等领域。
通过以上列点方式，我们对五种层析方法的原理和应用作了简要的介绍。
这些层析方法在不同领域的分析和检测中扮演重要角色，为我们获取准确的数据和信息提供了有效手段。
hic层析原理
hic层析原理HIC层析原理是一种常用的蛋白质纯化方法，具有选择性强、操作简单等优点，在生物制药、生物医学等领域得到广泛应用。
本文将围绕HIC层析原理，分步骤阐述其基本原理和实现过程。
一、HIC层析原理1. 静电交互作用HIC层析原理的基础是分子间的静电交互作用。
水相与有机相之间存在分子间的静电相互作用，这种相互作用随分子间距离的变化而变化，因此可通过控制溶液浓度或改变盐的种类和浓度引发分子的相互作用。
2. 比较亲水性HIC层析可以通过控制盐溶液的浓度和种类来达到分离目标蛋白的目的。
越亲水的蛋白质与水的相互作用力越强，因此在高盐浓度下，亲水性较强的蛋白质会与亲水剂发生静电交互作用并在层析柱上被吸附，相反，亲水性较弱的蛋白质则在低盐浓度时被吸附。
3. 物理表面等效性物理表面等效性是指，吸附质在两相界面上的化学势相等，即可以同时吸附或脱附某种物质。
因此HIC层析可以使不同蛋白质在水相和有机相之间达到化学势相等，使不同蛋白质达到一定程度的相互对等，进而避免所需蛋白质的非特异性吸附。
二、HIC层析实现过程1. 样品的准备样品可来源于细胞、组织、培养基等来源，样品需要经过破碎和离心等处理方法获得目标蛋白。
2. 层析柱的制备在层析柱中填充具有亲水性的支持物质，如葡聚糖、硅胶、羧甲基纤维素等。
然后通过化学修饰的方法，在支持物表面引入烷基、硫醇等亲疏水基团。
3. 层析条件的选择通过对盐的种类、浓度以及pH值等条件的选择，来调节样品的吸附和洗脱。
一般来说，当盐浓度增加时，吸附质的亲水性减弱，在低盐浓度时，吸附质的亲水性强。
4. 结果的分析通过检测目标蛋白在各个步骤中的含量来判断层析效果，包括种类、纯度、活性和结构等方面的分析。
三、结论HIC层析原理是一种非常重要的蛋白质纯化方法，通过控制盐溶液的浓度和种类，选择亲水性不同的支持物质来达到纯化目标。
具有简便、安全、可重复操作的优点，是蛋白质分离纯化领域中一种重要的手段。
层析的原理和应用
层析的原理和应用1. 层析的概念和基本原理层析（Chromatography）是一种将混合物中的组分分离和提纯的技术方法。
它基于组分之间在固定相和流动相之间的相互作用力的不同，使各种组分在系统中以不同速度迁移，达到分离的目的。
层析技术广泛应用于化学、生物、环境等领域。
层析技术的基本原理是利用流动相在固定相上的移动来实现物质的分离。
固定相通常是具有一定吸附性或分配性的材料，如硅胶、纸张、亲水性基质等。
流动相则是将待分离的混合物溶解在溶剂中，通过与固定相的相互作用，使各组分在固定相上以不同速率迁移。
2. 层析技术的分类和应用层析技术根据其基本原理和操作方式的不同，可以分为多种类型。
以下是其中几种常见的层析技术及其应用：2.1 薄层层析法（TLC）薄层层析法是一种在薄层材料上进行的层析技术。
常用的薄层材料包括硅胶和氧化铝等。
它具有简单、快速、经济的特点，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
2.2 柱层析法柱层析法是将固定相填充在柱中，通过流动相沿着柱内固定相的分布，实现各组分的分离。
根据固定相的不同，柱层析法又可分为凝胶柱层析和高效液相层析等。
柱层析法在药物分离纯化、天然产物提取、有机合成等领域具有广泛应用。
2.3 气相层析法（GC）气相层析法是将待分离的混合物蒸发为气体状态，通过在柱中固定相的分离，最终使各组分在检测器上进行定性和定量分析。
气相层析法广泛应用于石油化学、环境监测、食品安全等领域。
2.4 液相层析法（LC）液相层析法是将待分离混合物溶解于液相，在柱中利用固定相进行分离。
液相层析法根据流动相的不同，可分为常压液相层析和高效液相层析等。
液相层析法在制药、生物、环保等领域具有广泛应用。
2.5 离子层析法（IC）离子层析法是利用不同组分之间的化学亲合性进行分离的一种层析技术。
它广泛应用于水质分析、环境监测、生物学研究等领域，尤其是对离子的分析具有很高的选择性和灵敏度。
3. 层析技术的优点和局限性层析技术具有许多优点，使其成为众多分析方法中的重要手段。
亲和层析原理和步骤
基质类似物，抑制剂，辅酶 抗原，病毒，细胞 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 受体，载体蛋白 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞
（一） 载体的选择
1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液
体流动性 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）抗微生物和酶的侵蚀
2、常用载体
（1）纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化
（2）葡聚糖凝胶
特点： 化学及物理性质稳定
多孔性比琼脂糖低
（3）琼脂糖凝胶
浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B
四、应用
1、分离和纯化 2、分辨化学或遗传学上修饰的酶 3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质
结构研究 4、纯化人工合成的多肽和蛋白质 5、解释酶作用机理
载体
实验 亲和层析法分离豌豆凝集素
KL：解离常数 E： 酶
L： 底物
E+L
KL
EL
EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL] E0、L0：起始浓度 当L0》E0时 KL =[E0-EL][L0]/[EL] [EL]=[E0-EL][L0]/ KL Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL
凝胶浓度越低 结构越疏松 机械强度越低
（4）聚丙烯酰胺凝胶 特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
层析技术基本原理及应用
层析技术（Chromatography）是一种用于分离混合物中不同成分的重要方法，广泛应用于化学、生物化学、药学等领域。
以下是层析技术的基本原理及应用：
基本原理：
1. 分离原理：
-层析技术利用不同物质在固定相（stationary phase）和移动相（mobile phase）之间的分配系数不同来实现分离。
-样品在固相上受到吸附力和解吸力的影响，在移动相的推动下，不同组分以不同速度迁移，最终实现分离。
2. 类型：
-按照相对位置可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
-常见的层析技术包括气相色谱、液相色谱、离子色谱、薄层色谱等。
应用领域：
1. 生物化学：
-在蛋白质纯化、药物筛选、基因分析等方面广泛应用。
-用于分离和鉴定生物样品中的蛋白质、氨基酸、核酸等生物分子。
2. 制药工业：
-用于药物分析、药物提取和纯化等环节。
-常用于药物配方中主成分和杂质的分离和检测。
3. 环境监测：
-用于水质、大气、土壤等环境样品中有害物质的检测与分析。
-能够帮助监测环境中的污染物并进行有效处理。
4. 食品安全：
-在食品中添加剂、残留农药、重金属等的检测和分析中发挥作用。
-有助于确保食品安全和合规。
总的来说，层析技术通过精密的分离原理和操作流程，可以对复杂混合物进行高效分离和分析，为科学研究和工业生产提供了重要的技术支持。
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Testsolution: 1% acetone (about 0.5% of column volume), 0.2 AUFS at 280 nm. Alternatively use 2 M NaCl and conductivity monitor.
Efficiency
Efficiency depends on:
Maximum number of peaks in RPC > 150
0
10
6 5
7
20 ml
0.04
0.02 V0 0 0 5 10 15 20 25 Vt
0
200
400
ml
Remember: we are not purifying peaks, but proteins & peptides !
Resolution Efficiency Selectivity Symmetry
Resolution: the power to separate peaks
Maximum number of peaks in gel filtration ca 15
0.12 4 0.10 2 0.08 1 0.06 3
样品稳定性
离心后，测量 280 吸收和活性 pH：pH 2 - 9 (1 pH 间隔) 盐：0-4 M 氯化钠，0-2 M 硫酸氨 (0.5 M 间隔) 有机溶剂：0 - 50 % 乙腈，乙醇,甲醇 (10 % 间隔) 温度：4 - 40 摄氏度 (10 度 间隔) 时间：室温保存 (1 小时间隔)
High selectivity Lower selectivity
Selectivity: Selectivity
Is a measure of peak separation High selectivity gives baseline separations If selectivity is high, low efficiency can be tolerated (if large peak volume is acceptable).
Complementary to ion exchange (IEX) and gel filtration (GF) Mild, non-denaturing High selectivity High recovery Concentrating technique
Why use affinity chromatography ?
准备工作
考虑: 考虑
纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济
蛋白质特性: 蛋白质特性
稳定性
- pH - 离子强度 - 温度
分子量 等电点
样品准备
考虑: 考虑
根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 目的 稳定样品
Efficiency: the quality of your column 2 V N = 5.54 ( W r )
h
AU280
N = Number of theoretical plates
Wh = Peak width at half peak height
HETP = L/N
Vr
HETP = Height equivalent of theoretical plates L = Length of packed column bed
提高回收率方法
定期进行在位清洗 在样品稳定限制下保存和工作 尽量减少步骤 探索可接受分辨率下最大回收率的工艺 添加 EDTA 或二硫苏糖醇 用非目标蛋白洗柱使非特异性吸附位点饱和 使用防氧化剂避免氧化，尤其在高 pH 下 转用技术相似填料 转用回收率可接受的其他技术
选择层析方法
若对目标蛋白或样品不大了解，可尝试以下方法： 用分离范围宽广的凝胶过滤介质如Superose, Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白， 一步 即可得到高纯度样品；亦可用各种活化偶联介质 偶联目标 蛋白的底物、受体等自制亲和介质 体积大的样品，往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯 化； 高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化 疏水层析用高盐吸附，低盐洗脱的原理，洗脱的样品 又可 直接上离子交换介质；两种方法常被交替使用
Particle size of matrix Particle size distribution of matrix Packing quality of the column Sample (volume and viscosity) Flow rate
Why use gel filtration?
Why use ion exchange?
Useful at all stages of purification and at all scales Controllable High selectivity High capacity Concentratinghobic interaction ?
Pros Fastest for buffer exchange Very gentle, high yields Works in any buffer solution Removes dimers and aggregates Separates by size Cons Limited sample volume Poor selectivity compared with SDS-PAGE
Why use reversed phase ?
RPC gives the highest resolution Simple eluents: water and organic solvents Easy manipulation of resolution by changing parameters Removing specific contaminants Unfortunately denaturing for larger proteins
Efficiency: Efficiency
High efficiency Low efficiency
Is a measure of peak width High efficiency means sharp peaks High efficiency means a good packed column High efficiency can compensate for low selectivity
The three stages in downstream processing
层析工艺的建立
为何选择层析作为生物分子纯化方法？
不产生热 不产生外力 高回收率 高分辨率 线性放大，可预期 可自动化 大量成功例子
专门分离和纯化各类生物分子
•天然蛋白质 •重组和融合蛋白质 •肽类 •寡核苷酸 •质粒 •病毒 •抗生素 •生物碱 •。。。。。。等等
18
在AKTAprime 上用 HiTrap Desalting 柱脱盐
层析基本原理及工艺的建立
Chromatography Techniques
In order to purify proteins, peptides and nucleic acids we need powerful techniques.
Content
Principles of Operation Terms & Parameters Advantages & Disadvantages of different techniques Optimization of separation techniques
• 如 可 跟 目 标 分 子 兼 容 ： 可 选 择 有 机 溶 剂 • 添 加 硫 酸 链 霉 素 ， 或 锰 盐 沉 淀 核 酸 • 添 加 核 酸 酶 硫 酸 精 蛋 白
蛋 白 酶
分 解 目 标 分 子
• 添 加 蛋 白 酶 抑 制 剂 • 用 亲 和 层 析 去 处 蛋 白 酶 • 缩 短 粗 分 离 时 间 • 低 温 操 作 •
Figure: Purification of IgY from egg yolk after water extraction of lipids on HiTrap IgY Purification.
抗生素高分子杂质检测
Alkaloid Scale up on SP SrHP
Active component
Resolution factor Rs
Rs = 0.6
Resolution =
Rs = 1
Peak separation Peak width at ½ height
Rs = 4
Vr 2 − Vr 1 Rs = (W 1 + W 2 ) 2
Resolution: depends on efficiency and selectivity
样品预处理
污 染 物 絮 状 物 害 处 堵 柱 预 防 措 施 • 以 0.22 0.45 10000 µm g 滤 膜 过 滤 10 15 分 • 高 速 离 心 钟 • 细 胞 匀 浆 ： 离 心 500000g 脂 类 • 阻 断 配 基 作 用 • 引 致 凝 集 • 引 起 非 特 异 性 吸 附 核 酸 • 阻 断 配 基 作 用 • 高 黏 度 • 离 心 10000 g 10 15 分 钟 40000 -
Direct scale up from HiTrap SP to g level in SHMU on AKTA100
开发纯化工艺的注意点
建立检测方法 纯度和产量) 确立目标 (纯度和产量 纯度和产量 目标蛋白的性质 使用不同原理的纯化方法 减少步骤 尽量减少每步之间样品条件的改变 选用高选择性的方法 - 提高效率 快速去除蛋白水解酶 在早期步骤中缩小样品体积 工艺方法尽量简单! 工艺方法尽量简单