新测序常见问题分析
基因组测序数据分析中常见问题及解决策略
基因组测序数据分析中常见问题及解决策略基因组测序是一项重要的技术，已经广泛应用于生物医学研究、疾病诊断和个体化治疗等领域。
然而，基因组测序数据分析过程中常会遇到一些问题，正确解决这些问题对于准确地分析基因组数据至关重要。
本文将探讨基因组测序数据分析中常见的问题，并提出解决策略。
一、质量控制问题质量控制是基因组测序数据分析的第一步，主要目的是检查测序数据的质量，并去除质量较差的数据。
常见的质量控制问题包括低质量碱基、接头污染和重复序列等。
针对这些问题，可以采取以下策略。
首先，使用质量评估工具（如FastQC）检查测序数据的质量分布。
对于低质量碱基，可以通过Trimming或过滤掉具有低质量碱基的序列来解决。
接头污染可以通过使用Trimming工具删除接头序列来解决。
对于重复序列，可以利用特定软件（如Prinseq）去除这些序列，以保证数据的准确性和可靠性。
二、序列比对问题在基因组测序数据分析中，序列比对是其中一个关键步骤，目的是将测序数据与参考基因组进行比对，并得到每个位置的reads覆盖度。
常见的问题包括参考基因组选择和序列比对比对率等。
针对这些问题，可以考虑以下解决策略。
首先，对于参考基因组的选择，应根据具体研究目的和样本特点选择最适合的参考基因组。
对于高变异的样本，可以选择一致性较高的参考基因组进行比对。
其次，比对率低的问题可以通过选择合适的比对工具来解决。
目前常用的比对工具包括Bowtie、BWA等，根据具体情况选择适合的工具进行比对。
三、变异检测问题基因组测序数据分析的主要目的之一是检测样本中的变异，包括单核苷酸变异（SNV）、插入缺失变异（Indel）等。
常见的变异检测问题包括假阳性和假阴性。
针对这些问题，可以考虑以下策略。
首先，采用多个变异检测工具进行分析，不仅能够减少假阳性结果的产生，更能提高结果的准确性。
其次，对于假阴性结果，可以根据实验的目的进行进一步的验证，如采用Sanger测序等验证方法来提高结果的可信度。
测序常见问题分析与解答
测序常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。
的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。
如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。
提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。
PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“DNA测序样品准备及注意事项”部分的说明。
3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。
我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。
这样既误时间，又浪费客户的样品。
一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。
而甘油保存菌则容易污染。
制作穿刺菌时，可在1。
5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基(固体)中，37℃培养一个晚上后便可使用。
穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
4、与测序引物有关的问题：答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。
应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：(1)简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
DNA测序常见问题及分析
DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。
有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。
在序列的3’端易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。
测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。
这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。
有两种方法可以得到引物序列。
1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。
对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。
载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
DNA测序常见问题分析及解决办法总结PCR类型测序模板注意事项PCR类型测序模板注意事项•总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。
•对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR 产物作克隆后进行测序。
有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。
•经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。
有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。
纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。
•与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR 退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。
•PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。
•纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。
•若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp •各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。
引物浓度的换算关系∶总ng数 = pmole x 分子量/1000由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：•PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
DNA测序技术的使用中常见问题
DNA测序技术的使用中常见问题DNA测序技术是一项重要的科学工具，被广泛应用于生物医学研究、进化学、司法科学等领域。
然而，在使用DNA测序技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将介绍DNA测序技术使用中常见的问题，并提供相应的解决方案。
1. 样品质量问题在DNA测序之前，样品质量是至关重要的。
低质量的样品会导致测序结果的偏差和错误。
常见的样品质量问题包括样品的纯度不高、浓度不足或者样品受到了污染。
解决方案：- 提高样品纯化方法：使用恰当的纯化试剂和技术来提高样品的纯度，例如使用芳香族化合物或异维酮类物质。
- 检测样品浓度：使用光谱法或者比色法来测量样品中DNA的浓度，确保其符合测序要求。
- 避免样品污染：在样品处理过程中，严格遵守无菌操作规程，使用经过无菌过滤器过滤的试剂和器具。
2. 序列读取长度问题DNA测序技术可以产生从数十个碱基对到上百万个碱基对的序列。
然而，部分DNA测序技术的读取长度有限，这可能影响到某些研究或应用的结果。
解决方案：- 选择合适的测序方法：不同的测序方法具有不同的读取长度，选择适合自己研究目的的测序方法，以满足相关的研究需求。
- 使用测序技术的新发展：不断发展的测序技术，如第三代测序技术，具有较长的读取长度和更高的准确性，可以解决传统测序方法的限制。
3. 突变检测问题DNA测序技术不仅可以用于确定特定序列的顺序，还可以用于检测和鉴定突变。
然而，突变的检测可能受到多种因素的影响，如检测方法的灵敏度和特异性、突变类型的多样性等。
解决方案：- 选择合适的突变检测方法：不同的突变具有不同的检测方法，如SNP分析、插入和缺失突变的分析等。
选择合适的方法来检测特定类型的突变。
- 结合多种检测方法：结合使用不同的突变检测方法可以提高突变检测的准确性和可靠性。
- 验证突变结果：通过使用其他独立的测序技术或方法来验证突变结果，以确保结果的可靠性。
4. 数据分析问题DNA测序技术生成的数据量巨大，数据分析是一个复杂而耗时的过程。
测序常见峰图原因说明及建议解决方案
测序完成，重复序列后出现双 峰/乱峰/衰减/中断。
您的目的片段中有重复序列。
建议更换反向引物测序。
测序完成，插入后双峰，样品 非单克隆。
模板中含有两个或两个以上的相同 载体，但是插入片段不同。
重新转化后挑取单克隆测序。
菌液、质 粒、PCR 已纯化、
测序完成，Poly（A/T/C/G）结 构后出现双峰/乱峰/衰减/中断 。
测序完成，测序结果中断，可 能您的样品中含有高级结构， 或者GC含量较高。
可能您的样品中含有高级结构，或 GC含量较高。
建议更换反向引物测序或者用高 级试剂盒测序。
测序完成，测序结果衰减，可 能您的样品中含有高级结构， 或者GC含量较高。
可能您的样品中含有高级结构，或 GC含量较高。
建议更换反向引物测序或者用高 级试剂盒测序。
片断大小，是否设计引物测 致；或者公司安排的反应数不足以 确，再留言通知我们是否需要测
通？
将样品完全测通。
通。
测序完成，已测通。请确认片 断大小。
可能测得片段与您预期大小不符。
建议先分析已测得数据是否正 确，如有疑问，请及时在线留言 。
测序完成，结果双峰。
根据测序结果暂时无法推测造成的 建议可以考虑更换引物或者重新
求条带单一
实验取消，客户样品经鉴定， 样品不纯，不满足测序的要求 。
样品检测条带异常或者条带大小不 符
建议重新提供符合测序要求而且 片段大小正确的样品测序。质粒 （>100ng/ul；20ul）；PCR产物 （50ng/ul;20ul），PCR产物要 求条带单一明亮。
样品类型
测序情况
可能造成的原因
建议1：将测序样品用高级试剂 盒调整；得出较好的结果，再设 计引物继续实验；2：客户提供 目的片段，我们分析是否可以继 续设计引物；3：单向测通。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
常见问题
具体情况
可能的原因
处理办法
备注
样品准备问题
菌培养不好或失败
抗性不对或菌已死
核对抗性，尽可能提供载体信息。
或菌培养条件特殊
重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出
质粒拷贝数极低或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
质粒产量很低
低拷贝数质粒或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量，
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。
测OD值法不可靠,电泳检测
总量是否足够
已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
测序出现双峰或信号中断
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
质粒产量极低
客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。
用反向引物中出现套峰
可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱
DNA测序结果中常见的几个问题
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。
2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。
3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。
这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。
4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。
通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。
5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。
6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。
7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
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图例:双克隆2
现象: 载体序列及插入片段前半部分峰图单一,套峰出现在插入片段中间
原因: 1. pcr产物不纯,且产物的引物结合区以及峰图单一的序列 都一样 2. 部分模板碱基发生突变,双峰出现的位点是由碱基突变 的位置决定的,有时会一端正常一端双峰(插入片断超过一 个反应测序长度(800~900bp)), 或者两个反应都双峰 解决方法: 重新挑单克隆
图例:非特异扩增
现象: 峰图起始即双峰
原因及解决方法: 1. 对于质粒样品, 引物在序列上有两个结合位点(载体上 和插入片段上),换一个引物测序 2.对于PCR产物,有两个模板,且两个模板都能和引物结合 扩增, 换引物或克隆测序
图例:等位基因双模板
现象:序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，没有发生移码突变
2.测序常见图谱分析
图例:双克隆1
现象: T载体序列峰图正常, 连接位置处出现套峰
原因: 1.有插入片段的载体和空载体同时存在 2.PCR产物用T载体进行连接时,其片段能以正反两个方向 插入T载体 解决办法： 重新挑取单克隆
备注: 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段， 并不足以证明模板的单一
解决方法: 采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序
测序常见问题分析
主讲人: 张隽辉
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1. 序列结构对测序的影响
图例：poly结构Fra bibliotek原因: 主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上 滑动，导致随后的峰型变乱 或者移码 解决办法: 此类样品通过对其反向互补序列进行测序，通过 拼接可以得到模板全长序列.
图例：重复结构
原因: 重复结构会导致测序复制框的滑移，另外测序试剂采用 了I, U 代替G, T, 与模板结合能力较弱, 测序酶很难延伸, 信号会迅速衰减或峰谱很乱 解决办法： 使用反向引物对模板进行测序，测到重复序列反向互 补位置时，即可完成模板全长的拼接,一般测A\C重复 序列比G\T要容易一些
图例：回文结构
位点94至137碱基前后互补, 形成回文结构，该结构导致 后面的信号衰减，出现错误的判读。
图例: 特殊结构
现象: 信号在73bp（信号峰图2700处）突然中断， 测序PCR反应终止
原因: 变性后的单链在该处很可能互补或在全序列中有大的 特殊结构，造成严重的二级结构，使dNTP 和 ddNTP不 能和模板结合, 测序酶无法正常延伸 解决方法: 酶切,做亚克隆测序