乳腺生物反应器教学提纲
动物乳腺生物反应器的研究概况
动物乳腺生物反应器的研究概况摘要：转基因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并从转基因动物乳汁中获取重组蛋白。
近年来，生物学和分子生物学研究领域的成就促进了该技术的蓬勃发展。
本文简要概述了转基因动物乳腺生物反应器的基本概念、原理、特点及应用，并重点阐述了其研究现状及前景，从而探讨其存在的问题。
关键词：转基因动物；乳腺生物反应器；进展Abstract：Mammary gland bioreactor of transgenic animals is a useful biological technology, which expresses foreign genes under the direction of special promoters of the mammary gland as regulating components in the mammary gland and produces functional pharmaceutical proteins in milk．In recent years，achievements of biology and molecular biology accelerate the development of this technology. This paper briefly reviews the basic concepts, principle, chara- cteristics and applications of the mammary gland bior- eactor of transgenic animals，especially summarizing its current research status and bright future，meanwhile discusses the problems existed．Key words:transgenic animals；mammary gland bioreactor；progress前言21世纪是生命科学突飞猛进的时代，生命科学在人类生活中占有极为重要的位置。
生物高中选修：基因工程部分提纲
专题1 基因工程基因工程，也称作DNA重组技术或DNA拼接技术或转基因技术。
是在体外对不同生物的DNA分子进行拼接,获得重组DNA，从而定向改变生物性状的技术。
基因工程的原理：基因重组一、基因工程的基本工具基因工程的基本工具包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体1.限制性核酸内切酶（也叫作限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离、提纯得到。
（2）特点：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此限制酶具有专一性。
例如：EcolR I识别的序列是GAATTC，切割位点在GA碱基之间。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
其中在中轴线两侧进行切割形成的是黏性末端，沿中轴线切割形成的是平末端。
2. DNA连接酶，包括E·coliDNA连接酶（从大肠杆菌内提取得到）和T4-DNA连接酶（从T4-噬菌体中提取得到）两种DNA连接酶作用：能将DNA片段连接起来，并形成磷酸二酯键。
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：①相同点：缝合的都是磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶不仅能连接黏性末端也能连接平末端。
(2)DNA连接酶与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段的末端DNA连接酶是将两个DNA片段连接。
3.载体载体的功能是将目的基因运到受体细胞内。
（1）作为载体具备的条件：①能自我复制②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的选择和鉴定（筛选出含有目的基因的受体细胞）。
④对受体细胞无害；（2）最常用的载体是质粒,存在于细菌拟核之外，具有自我复制能力的裸露的小型环状DN A分子。
（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒二、基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取；第二步：基因表达载体的构建第三步：将目的基因导入受体细胞；第四步：目的基因的检测与鉴定第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：人们所需要的，能控制蛋白质的基因。
动物乳腺生物反应器
动物乳腺生物反应器动物物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。
乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛，从小分子肽到大分子复杂蛋白质，从生物活性酶到抗体、病毒抗原蛋白均可有效生产。
利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白的优点有：（1）生物活性高，无污染。
动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性。
（2）易分离提纯，成本低廉。
现有的一些人药物蛋白之所以昂贵，除了原料难以收集外，另一原因是分离提纯极为困难成本极高。
而动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。
（3）产量高。
外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克到几十克，小群转基因大家畜的产量即可满足全世界市场的需求。
动物乳腺生物反应器已经成为生物技术领域最具开发应用前景的尖端方向。
动物乳腺生物反应器发展简史转基因动物的研究始于20世纪80年代初。
1980年，Gordon等将重组DNA用显微注射法导入小鼠受精卵原核，首次获得了整合有外源基因的小鼠。
1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠受精卵中，首次获得了体重为正常小鼠2 倍以上的“超级小鼠”并提出了从转基因动物中提取药物蛋白的设想。
此后几年的许多研究奠定了转基因动物技术体系的基础，但真正的乳腺生物反应器研究则始于1987 年Gordon 等的工作，他们将组织型纤溶酶原激活剂（tPA）与小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠，同年，世界上第一只能从乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的转基因绵羊在英国罗斯林研究所诞生。
从此，开始了乳腺生物反应器的实用性研究。
乳腺生物反应器课件
1991年，Brem等报道乳腺表达牛凝乳酶的转基因兔，表达 水 平达到1～10g/L。
1992年，Ve-lande：等报道了乳腺表达人C蛋白的转基因猪，表 达水平达到1g/L以上。
目前，从转基因动物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ
和人C蛋白等基因工程产品已进入临床试验阶段，并已初步
202形0/3/成27 以转基因动物乳腺为主要生产手段的医药产业。
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乳腺生物反应器的研究进展
国外研究进展
20世纪80年代末提出动物乳腺生物反应器的设想
1987年，Gordon等首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织纤 溶酶原激活剂(tPA)基因。
1991年，WrightG等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基因 绵羊，表达水平高达35g/L，在世界范围内引起了极大的轰 动。
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2020/3/2714 Nhomakorabea7
国内研究进展
20世纪80年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反应器的构 想 ， 并成功获得表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔 ，为 我国 通过转基因动物的途径获得珍贵药物奠定了基础。
1995年，我国首次在小鼠乳腺中成功地表达了人的基因；
1996年10月上海医学遗传研究所与复旦大学合作研制成功的 能在乳腺中表达人凝血因子Ⅳ的转基因羊。
动物乳腺生物反应器
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转基因动物技术
转基因动物最诱人的前景是
作为生物反应器，利用它生
产人类所需要的生物活性产 品或药物，其常用方法是把 目的基因在血液循环系统、 唾液腺或乳腺等器官或组织 中表达，从而获得人类需要 的目的产物。
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加快家畜品种的改良 速度，提高肉、奶、 蛋的产量和品质，生 产珍贵的药用蛋白,为 大量患者造福。
动物乳腺生物反应器
由于动物乳腺生物反应器的关 健技术需要转基因技术，根据 人们目前对转基因产品的反应， 动物乳腺生物反应器作为可能 的新产业
高技术会解决相关疑问，动物 乳腺反应器新产业会大发展
Q4
•
乳腺生物反应器生产重组蛋白的优势 动物乳腺生物反应器的核心是通过乳腺组织特 异性启动子驱动的外 源基因在动物乳腺组织中高效 特异地表达，从乳汁中获取目的产物。与其他制药 方式相比，它具有多方面 的优势：
Q1
作为高技术产业的动其经济效 益肯定非常好。
Q2
但，需要慎重发展。
根据你掌握的知识，在5～10 年内动物乳腺生物反应器生产 的药物与传统制药相比，哪个 产业更大？
Q3
重组蛋白活性高
药物蛋白产量高
对动物影 响小 环境 污 染低
生产成 本低
动物乳腺生物反应器 与新产业发展
动物乳腺生物反应器 的关健技术有哪些？
动物胚胎技术
表达载体
转基因技术
蛋白质提纯技术
常规畜牧技术
转基因技术
以体细胞克隆技术 显微注射技术 精子载体技术 胞内精子注射技术（ICSI） 逆转录病毒侵染技术 动物体细胞核移植技术
假若现在有审批合格的动物乳 腺生物反应器产品，你愿意使 用吗？
重组蛋白活性高药物蛋白产量高对动物影响小环境污染低生产成本低经济回报丰厚q4由于动物乳腺生物反应器的关健技术需要转基因技术根据人们目前对转基因产品的反应动物乳腺生物反应器作为可能的新产业高技术会解决相关疑问动物乳腺反应器新产业会大发展?乳腺生物反应器生产重组蛋白的优势动物乳腺生物反应器的核心是通过乳腺组织特异性启动子驱动的外源基因在动物乳腺组织中高效特异地表达从乳汁中获取目的产物
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乳腺生物反应器PPT课件
转基因动物的成活率低
在目的基因的分离和改造，乳腺特异 表达载体的构建及转基因技术的关键性技 术上存在缺陷，无法保证对基因的定点整 合，因此转基因动物常会出现繁殖力下降、 胚胎早期死亡等各种生理及病理缺陷 。
安全性
动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修 饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体保护系统 可对所有外源性物质产生排斥反应，如出现蛋白 质水解等问题。 此外乳汁中可能含有的微生物及 不完全修饰的多肽都对产品的安全性构成了极大 的威胁，所以在分离过程中要去除所有可能引起 人类变态反应的蛋白质，同时对含量低的产物加 以纯化，才能得到与目的蛋白结构、功能和理化 特性相同的产品。 另外，要防止把动物性疾病传 染给人。
步骤
获取目的基因
构建基因表达载体（ 在基因前加特异表达的启动子）
显微注射导入哺乳动物受精卵中
形成胚胎
将胚胎送入母体动物
发育成转基因动物（只有在产下的雌性动物个体中，转入的基因才能表达）
转基因动物生产红细胞生成素（ EPO ）
将EPO DNA分别以HindⅢ和BamHI酶切，回 收5.4kb的HindⅢ/BamHI片段，插入pGEM7zf(+)载体，再将867bp的BLG启动子插入EPO 基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达载体 pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通过显微注射方法得 到转基因小鼠，其乳腺中的EPO含量可达 0.5μg/ml。
乳腺生物反应器的研究进展
国外研究进展
20世纪80年代末提出动物乳腺生物反应器的设想
1987年，Gordon等首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织 纤溶酶原激活剂(tPA)基因。
1991年，WrightG等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基 因绵羊，表达水平高达35g/L，在世界范围内引起了极大的 轰动。
生物乳腺反应器的原理及进展
动物乳腺生物反应器的原理及进展摘要：动物乳腺生物反应器技术是转基因技术的应用，于上世纪80年代提出，其目的是利用动物乳腺产生目的蛋白。
利用该技术生产的蛋白具有低成本，高活性，易提取纯化的优点。
虽然该技术尚处于发展时期，但具有广阔的应用前景和巨大地商业潜力，是许多公司大力发展的对象。
关键词：动物乳腺生物反应器、原理、进展、优点动物乳腺生物反应器（mammary gland reactor）是指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。
1生物反应器(bioreactor) 经历了3 个发展阶段：细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。
细菌基因工程产物往往不具备生物活性,必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后, 才能成为有效的药物,而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻,成本太高,限制了规模生产。
动物生物反应器具有产品质量高,容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。
它是在转基因技术体系基础上发展起来的。
7自从上世纪80年代出现以来，已经取得了许多突破，现己成为生物技术研究的热点。
并向商业化阶段转变，显示了广阔的应用前景。
并且利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用奶，以期望获得既能满足蛋白质需要，又能增加抵抗力的品质全面的奶，为人类服务。
21、动物乳腺生物反应器的原理乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。
1 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。
它是一个专门化的分泌腺体，可以生产出具完全生物活性的药用重组蛋白质，其纯化简单，生产投资及成本相对较少，而且对环境不具污染性，也被称为“分子农场”。
动物乳腺反应器
blot results of the different samples as they correspond to SDSPAGE
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6 The stability of the rhLF in artificial gastric solution and intestinal juice
Purification of the rhLF, using cation exchange chromatography: peak 1 and peak 2, protein peak
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M: marker; 1: skimmed milk; 2:defatted whey without casein; 3: sample of peak 1; 4: sample of peak 2; P: natural hLF (5 μg).
SDS-PAGE results of the hLF (a) and rhLF (b) digested in stimulated gastric solution
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M:
marker; lanes 1–2: 10 min; lanes 3–4: 30 min; lanes 5–6: 1 h; lanes1, 3, 5: hLF; lanes 2, 4, 6: rhLF
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bovine lactoferrin
no statistical differences were observed between the groups.
transgenic cows ( ) control cows ( )
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Serum amyloid A
• In the transgenic group, mean SAA was lower throughout the study period and never exceeded 15 mg/l
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国内研究进展
20世纪8Leabharlann 年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反应器的构 想 ，并成功获得表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔 ，为 我国通过转基因动物的途径获得珍贵药物奠定了基础。
1995年，我国首次在小鼠乳腺中成功地表达了人的基因；
1996年10月上海医学遗传研究所与复旦大学合作研制成功的 能在乳腺中表达人凝血因子Ⅳ的转基因羊。
生物活性与天然蛋白几乎完全一样,极易提纯。
应用
组织纤溶酶原激活剂(TPA)：由美国遗传技术公司开发的
血栓溶解剂，1987 年11月经联邦食品及药物管理局(FDA) 批准上市。1988年的销售额为1.5～1.6亿美元，1989年为 1.8～1.9亿美元。今后每年的市场销售额约为2～2.5亿美 元。
重组人抗凝血酶ii:世界上第一个动物乳腺生物反映器重组
乳腺生物反应器的研究进展
国外研究进展
20世纪80年代末提出动物乳腺生物反应器的设想
1987年，Gordon等首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织 纤溶酶原激活剂(tPA)基因。
1991年，WrightG等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基 因绵羊，表达水平高达35g/L，在世界范围内引起了极大的 轰动。
根据目的蛋白表 达部位的不同可
分为乳腺生物反 应器、血 液生物
反 应 器 、卵 生 物 反 应 器 、尿 生 物 反 应器、精 囊腺生物反应器、 唾液腺生物反应 器等。
乳腺生物反应器的原理及步骤 乳腺生物反应器的研究进展 乳腺生物反应器的优点及其应用 乳腺生物反应器的存在的问题
乳腺生物反应器的原理及步骤
乳腺生物反应器的优点及其应用
➢表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性
利用DNA重组技术的微生物来生产的药用蛋白,由 于细菌等微生物不能进行蛋白质合成后的加工, 因 而生物活性低, 并且具有免疫原性。
➢产品成本低,可以大规模生产
药物其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术 的100倍
➢产品质量高,易提纯
步骤
转基因动物生产红细胞生成素（ EPO ）
将EPO DNA分别以HindⅢ和BamHI酶切，回 收5.4kb的HindⅢ/BamHI片段，插入pGEM7zf(+)载体，再将867bp的BLG启动子插入EPO 基因之前EcoR、ClaI位点，构建表达载体 pGEM-3zf(+)β-LG-EPO。通过显微注射方法得 到转基因小鼠，其乳腺中的EPO含量可达 0.5μg/ml。
转基因动物的成活率低
在目的基因的分离和改造，乳腺特异 表达载体的构建及转基因技术的关键性技 术上存在缺陷，无法保证对基因的定点整 合，因此转基因动物常会出现繁殖力下降、 胚胎早期死亡等各种生理及病理缺陷 。
安全性
动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修 饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体保护系统 可对所有外源性物质产生排斥反应，如出现蛋白 质水解等问题。 此外乳汁中可能含有的微生物及 不完全修饰的多肽都对产品的安全性构成了极大 的威胁，所以在分离过程中要去除所有可能引起 人类变态反应的蛋白质，同时对含量低的产物加 以纯化，才能得到与目的蛋白结构、功能和理化 特性相同的产品。 另外，要防止把动物性疾病传 染给人。
原理:
应用重组 DNA技术和转基因技术，将目的基 因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎 移植得到转基因乳腺表达多肽药物、工业酶、疫 苗和抗体等蛋白的技术。
外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因 的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期 乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置 于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中 表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。
1991年，Brem等报道乳腺表达牛凝乳酶的转基因兔，表达 水平达到1～10g/L。
1992年，Ve-lande：等报道了乳腺表达人C蛋白的转基因猪， 表达水平达到1g/L以上。
目前，从转基因动物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶 Ⅲ和人C蛋白等基因工程产品已进入临床试验阶段，并已初 步形成以转基因动物乳腺为主要生产手段的医药产业。
蛋白药物。重组人抗凝血酶iii具有抑制血液中凝血酶活性 ，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失 症有显著效果。
2010年，转基因动物生产的重组蛋白产品销售额达 到350 亿美元，生产的药物将占整个基因工程药 物种类的90%以上。
乳腺生物反应器的存在的问题
目的基因在动物基因中的整合问题
由于目的基因在动物基因中的整合是 随机的，因此包括整合位点、整合的拷贝 数等机制还不清楚。所以易发生调节失控、 遗传不稳定、表达率不高等问题。
动物乳腺生物反应器
转基因动物技术
转基因动物最诱人的前景是
作为生物反应器，利用它生
产人类所需要的生物活性产 品或药物，其常用方法是把 目的基因在血液循环系统、 唾液腺或乳腺等器官或组织 中表达，从而获得人类需要 的目的产物。
加快家畜品种的改良 速度，提高肉、奶、 蛋的产量和品质，生 产珍贵的药用蛋白,为 大量患者造福。