生物的制药工程的下游技术
生物工程下游技术思考题答案
⽣物⼯程下游技术思考题答案⼀．绪论1、从某⼀动物培养的细胞中分离某⼀抗体(⼀蛋⽩的代表）的⼀般⼯艺过程。
答：⽣物⼯程下游技术的⼀般⼯艺过程（p12）2、分离纯化某⼀酶制剂的主要步骤和结果如下表：（（2）亲和层析的原理是什么？3、产品的分离提取⼯艺应考虑那些因素？答：⽣物分离过纯化过程的选择准则（P16）①步聚少，成本低②次序合理③产品规格（注射，⾮注射）④⽣产规模⑤物料组成⑥产品形式固体：适当结晶，液体：适当浓缩⑦产品稳定性⑧物性溶解度，分⼦电荷，分⼦⼤⼩，功能团，稳定性，挥发性⑨危害性⑩废⽔处理第⼆章发酵液预处理1．沉降速度离⼼的原理。
（p15）答：沉降速度法：主要⽤于分离沉降系数不同的物质。
2．沉降平衡离⼼的原理。
（p15）答：沉降平衡法：⽤于分离密度不同的物质。
如梯度密度离⼼。
3．差速离⼼的概念。
（p15）答：采⽤不同的转速将沉降系数不同的物质分开的⽅法。
4． rpm与RCF的换算关系。
5.已知某⼀离⼼机的转⼦半径为25cm，转速为1200r/min，计算相对离⼼⼒为多⼤？第三章细胞破碎1除去发酵液杂蛋⽩质的常⽤⽅法有那些？答：杂蛋⽩质的除去（p6）(1) 沉淀法：蛋⽩质是两性物质，在酸性溶液中，能与⼀些阴离⼦（三氯⼄酸盐、⽔扬酸盐）形成沉淀；在碱性溶液中，能与⼀些阳离⼦（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等）形成沉淀。
(2) 变性法：使蛋⽩质变性的⽅法很多，如：加热，调节pH，有机溶剂，表⾯活性剂等。
其中最常⽤的是加热法。
(3) 吸附法：加⼊某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋⽩质⽽除去。
2产品的分离提取⼯艺应考虑那些因素？答：(1) 是胞内产物还是胞外产物；(2) 原料中产物和主要杂质浓度；(3) 产物和主要杂质的物理化学特性及差异；(4) 产品⽤途和质量标准；(5) 产品的市场价格；(6) 废液的处理⽅法等。
3发酵液过滤与分离的困难的原因及解决⽅法。
答：第⼀节发酵液过滤特性的改变微⽣物发酵液的特性可归纳为： (P3)①发酵产物浓度较低，⼤多为1％⼀10％，悬浮液中⼤部分是⽔；②悬浮物颗粒⼩，相对密度与液相相差不⼤；③固体粒⼦可压缩性⼤；④液相粘度⼤，⼤多为⾮⽜顿型流体；⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空⽓氧化、微⽣物污染、蛋⽩酶⽔解等作⽤的影响。
基因工程制药中常用的上、下游技术
离子交换层析法
基于离子交换在不同介质之 间的特性，制备氢氧化微晶 包埋的阴阳离子交换膜在离 子交换残基的基础上:定向压 缩膜内阳离子、阴离子间的 吸附分离。
亲和层析法
利用亲和柱的亲和性选择性 地在蛋白质中寻找高结合性 靶分子，逐渐实现蛋白质的 纯化。
重组蛋白生产
重组蛋白生产是指在细胞内表达外源的基因产物，通过状态微调，最终得到高质量的蛋白质样品。
基因工程制药用途广泛，对于疫苗、抗体、激素等方面展现了重要价值。随着技术的不断发展和完善， 组合技术的应用将是基因工程医药发展的下一个阶段。
1
HIV疫苗的开发
以基因工程技术为核心的疫苗研发取得了很大的进展，HIV的防控也凸现出更多值得期待 的前景。
2
癌症治疗药物
永久性转基因移植可提供生活质量更高的癌症治疗方案。
考虑维持培养细胞的健康状态
选择合适的生长移植原、营养密集型的培养基，延长细胞寿命，保持细胞的生长平衡。
纯化与分离
在基因工程制药中，不同的蛋白质表达量不同，而且蛋白质含量非常低，经过纯化和分离，能够将不同的蛋 白质分离开来，并增加效率。
摸索分离
对目标蛋白质的物理化学特 性、分子结构等方面进行初 步测试，采用分离纯化相结 合的复合策略。
基因工程制药中常用的上、 下游技术
基因工程制药是指利用DNA重组技术等手段，改变微生物、植物、动物等生 物体内的合成代谢途径，大量生产用于医疗或其他用途的具有特异性活性的 蛋白质及其他分子制品。
基因克隆
基因克隆是指将外源基因插入宿主细胞中，实现基因的复制及增加。常见的克隆载体有质粒、噬菌体等，其中 质粒维护简单、较稳定，被广泛应用于基因工程制药的克隆中。
1 全方位筛选
通过演化、高通量筛选等 手段，找到合适的工程菌 株，以获得最大刺激目标 基因表达的效果。
生物制药上下游工艺
生物制药上下游工艺生物制药是利用生物技术和生物工程原理进行药物生产的一种方法，其中包括上游工艺和下游工艺。
上游工艺主要涉及到细胞培养、发酵及分离纯化等步骤，而下游工艺则包括药物纯化、制剂制备和包装等环节。
本文将逐步回答关于生物制药上下游工艺的相关问题。
第一部分：生物制药上游工艺上游工艺是生物制药生产过程中的第一步，它主要涉及到选择合适的细胞株、培养条件和培养基配方等。
下面将一步一步回答关于上游工艺的问题。
问题1：什么是细胞培养？回答：细胞培养是指将种子细胞以无菌的方式放入合适的培养基中，提供适宜的生长条件以使细胞繁殖和生长的过程。
培养细胞是进行生物制药的重要环节之一。
问题2：细胞培养的步骤有哪些？回答：细胞培养一般包括以下几个步骤：1. 细胞株的选择：选择合适的细胞株是保证生物制药生产成功的重要环节；2. 细胞株的扩增：将选定的细胞株扩增至足够的数量，以进行后续的发酵；3. 细胞的接种：将培养好的细胞注入到发酵罐或生物反应器中，使其在无菌环境中持续生长和繁殖；4. 细胞的培养：提供适宜的培养基和培养条件，如温度、pH值、营养物质等，使细胞继续生长和产生目标产物。
问题3：什么是发酵？回答：发酵是指利用微生物或其他细胞系在合适的培养基条件下进行生物化学反应的过程。
在生物制药中，发酵主要是指利用细菌、真菌、动植物细胞等生物来产生药物。
问题4：发酵的步骤有哪些？回答：发酵一般包括以下几个步骤：1. 发酵罐的准备：准备好发酵罐，包括清洗、消毒等过程；2. 培养基的配制：按照特定的配方和工艺要求，配制适合细胞生长和代谢的培养基；3. 初始接种：将培养好的细胞接种到发酵罐中，并提供适宜的环境条件使其生长和繁殖；4. 发酵过程控制：监测培养液的温度、pH值、氧气供应等参数，调节发酵条件，使细胞正常生长和产生药物；5. 产物收获和分离：当目标产物达到一定的浓度时，通过分离纯化等工艺将其提取出来。
第二部分：生物制药下游工艺下游工艺是生物制药生产过程的后续步骤，主要包括药物纯化、制剂制备和包装等环节。
生物制药工程下游技术
一、概念1、生物制药: 是指利用微生物学、生物学、医学、生物化学等研究结果, 从生物体、生物组织、细胞、体液等,利用生物技术原理和方法制造一类用于预防、诊疗和诊疗制品。
2、基因工程: 是指在体外按既定目和方案, 将一目基因片段, 与载体结合, 组成DNA重组体, 随即引入受体细胞中,随细胞繁殖而扩增, 同时也可进行基因表示, 产生特定基因产物或新性状遗传物质技术。
3、载体: 是携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表示工具, 载体本质是DNA 。
4、质粒: 是染色体外能自主复制双链闭环DNA分子。
5、沉淀: 是溶液中溶质由液相变成固相析出过程。
6、盐析: 是一个依据蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度低特点来分离蛋白质方法。
7、等电点沉淀法: 是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而多种蛋白质又含有不相同电点特点进行分离方法。
8、凝胶过滤层析: 是以多孔性凝胶填料为固定相, 按分子大小次序分离样品中各个组分液相色谱方法。
9、离子交换层析: 带有不一样电荷物质, 对层析柱中离子交换剂亲和力不一样, 通达改变冲洗液离子强度和pH值,将物质依次从层析柱中洗脱分离出来方法。
10、亲和层析: 就是依据生物大分特异性分子识别建立一个纯化方法11、膜分离: 在压力、电场或温差作用下, 一些物质能够透过膜, 而另些物质则被选择性拦截, 从而使溶液中不一样组分, 或混和气体不一样组分被分离,这种分子级分离称为膜分离。
12、电泳: 在直流电场中, 带电粒子向带符号相反电极移动现象称为电泳。
13、分光光度技术: 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质吸收光谱, 利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析方法二、简答题1、现代生物制药下游技术包含哪些内容1.生物反应器及大规模细胞培养2.生物细胞破碎技术3.生物分子分离纯化技术4.生物分子含量检测技术5.生物分子判定技术6.生物分子活性检测技术2、基因工程基础操作过程包含目基因制备、基因载体选择、DNA重组、DNA重组体转化、重组体筛选和判定、外源基因表示3、生物化学样品制备特点⑴生物材料组成极其复杂, 常常包含有数百种乃至几千种化合物。
基因工程制药中常用的上、下游技术
• HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK) • Myc-tag (EQKLISEEDL)
和Plac杂合成的Ptac，启动强度分别是Ptrp的3倍
和 Plac 的 11 倍。启动子的强弱程度还与所控外源 基因的性质密切相关。
优化转录调控元件
双启动子表达载体
• 为提高转录活性，增加外源基因的 表达量有时将两个启动子串联到一起。 • 两个不同的启动子串联， 如 PR+T7 • 两个相同的启动子串联, 如 T7+T7
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型表达的优缺点
• 优点：
• 外原基因的表达量极高，对宿主细胞的 生长和代谢影响小 • 抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强 • 目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化
• 缺点：
• 必须复性
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
分泌型表达
• 分泌型表达的特点： • 在 N 端加上能够跨膜的信号肽序列。这对 重组蛋白的折叠可能有一定好处；由于跨膜是 逐个进行的，蛋白间的交联机会较少；周质中 的蛋白酶活性比胞质低；周质蛋白仅占菌体总 蛋白的4%，使之易于纯化。但分泌到周质中的 重组蛋白其构象不一定是天然构象，在周质中 的重组蛋白也可能形成包涵体。
外源基因染色体定位整合原理
•
根据DNA同源交换原理，在外源 基因两侧各组合一段与染色体特定 部位完全相同的同源序列。外源基 因越长同源序列也需越长。
外源基因在大肠杆菌 中的高效表达的方法
《生物下游技术》课件
目标产物的提取和纯化
1
提取和纯化是在细胞破碎后进行的步骤，其目的 是将目标产物从细胞碎片和其他杂质中分离出来 。
2
根据目标产物的性质，可以选择不同的提取和纯 化方法，如沉淀法、萃取法、吸附法、色谱法等 。
在生物下游技术中，吸附技术主要用于蛋白质、酶等生物活性 物质的分离和纯化。常用的吸附剂有硅胶、活性炭、树脂等。
色谱分离技术
色谱分离技术
利用不同物质在固定相和流动相之间的吸附、分配、离子 交换等作用力不同，实现物质分离的一种技术。
色谱柱
是实现色谱分离技术的核心部件，根据分离要求选择合适 的色谱柱填料和粒径。
在食品行业的应用
食品加工
利用生物下游技术提取和纯化食 品中的营养成分，如蛋白质、脂 肪和糖类等，用于生产食品添加
剂、营养补充剂等。
食品安全检测
利用生物下游技术检测食品中的有 害物质、微生物和农药残留等，保 障食品安全。
食品品质改良
利用生物下游技术对食品进行改性 ，提高食品的口感、色泽和保质期 等。
利用生物下游技术对植物 进行基因编辑和改良，培 育抗逆性强、产量高、品 质优良的农作物品种。
植物病虫害防治
利用生物下游技术生产具 有抗病虫害功能的转基因 植物，提高植物的抗病性 和抗虫性。
动物养殖
利用生物下游技术提取和 纯化动物生长所需的营养 成分，提高动物生长速度 和养殖效益。
THANKS
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智能化和自动化技术
智能化和自动化技术将应用于生物下游技术中，实现生产过程的自 动化控制和智能化管理，提高生产效率和降低成本。
制药工艺
制药工艺生物制药包括上游工艺、下游工艺和制剂工艺过程。
上游工艺以生物材料为核心，主要包括基因分子操作与重组、固定化、细胞融合等技术；下游工艺以药物后处理为核心，包括细胞大规模培养、药物的提取和纯化以及质量控制等。
一：概述：生物药物：是利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、生物分离与纯化技术和药学的原理与加工方法进行加工、制造而成的一类预防、诊断疾病的物质。
生物药物主要来源：动物脏器；血液、分泌物和其他代谢产物；海洋生物；植物；微生物。
生物制药：是利用生物体或生物过程在人为设定的条件下生产各种生物药物的技术，研究的主要内容包括各种生物药物的原料来源及其生物学特性、各种生理活性物质的结构与性质及其结构与疗效间的相互关系、制备原理、生产工艺及其质量控制等。
生物制药的发展过程:1天然生物材料的提取制药2发酵工程制药3酶工程制药4细胞工程制药5基因工程制药。
生物药物的分类：按照化学结构和特性：1氨基酸类药物及其衍生物2多肽和蛋白类药物3酶类药物4核酸及其降解物和衍生物5糖类药物6细胞因子7生物制品类；按原料来源：1人体组织来源的生物药物2动物组织来源3植物来源4微生物来源5海洋生物来源；按生理功能和用途：1治疗药物2预防药物3诊断药物4其他生物医药用品。
二：天然生物材料的提取制药：生化药物：从生物体分离纯化，用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的用于预防、治疗和诊断疾病的一类生化物质。
生化药物最大特点：1.来自于生物体，即来自动物、植物和微生物；2.为生物体中的基本化学成分。
氨基酸类药物的常用生产方法：1蛋白水解提取法2微生物发酵法3化学合成法4酶合成法；常用提取分离法：1溶解度和等电点法2特殊沉淀法3离子交换法4氨基酸的结晶与干燥。
常用细胞破碎方法：1机械法2物理法3化学法和酶法。
多肽和蛋白质类药物的纯化：1利用溶解度不同的纯化方法2利用分子结构和大小不同的纯化方法3利用电离性质不同的纯化方法4利用生物功能专一性的不同纯化方法。
生物工艺下游技术
冷冻罐-母瓶-子瓶-一级种子-二级种子-发酵罐（上有）-发酵液的预处理与固液分离-提取-精制-成品加工-成品（最后纯化）下游加工过程是生物工程的一个组成部分。
生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程。
下游技术：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。
整个下游过程应：时间短，温度低，PH适中（选择在生物物质的温度范围内），严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角）和传统产品抗生素的生产是一致的。
要防止菌体扩散，一般要求密封环境下操作。
发酵液预处理：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。
钙离子，可用草酸，反应生成的草酸钙能促使蛋白质凝固，提高滤液（也称为原液）质量.镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。
Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3 +12K+杂蛋白去除方法：热变性、沉淀、大幅度改变pH、加有机溶剂、吸附法凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。
絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩散双电层的结构。
布朗运动凝聚：是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。
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一、概念1、生物制药：是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，利用生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
2、基因工程：是指在体外按既定的目的和方案，将一目的基因片段，与载体结合，构成DNA重组体，随即引入受体细胞中，随细胞繁殖而扩增，同时也可进行基因表达，产生特定的基因产物或新性状的遗传物质的技术。
3、载体：是携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，载体本质是DNA 。
4、质粒：是染色体外能自主复制的双链闭环DNA分子。
5、沉淀：是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
6、盐析：是一种根据蛋白质在高浓度盐溶液中的溶解度低的特点来分离蛋白质的方法。
7、等电点沉淀法：是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。
8、凝胶过滤层析：是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
9、离子交换层析：带有不同电荷的物质，对层析柱中的离子交换剂亲和力不同，通达改变冲洗液的离子强度和pH值，将物质依次从层析柱中洗脱分离出来的方法。
10、亲和层析：就是根据生物大分特异性的分子识别建立的一种纯化方法11、膜分离：在压力、电场或温差作用下，某些物质可以透过膜，而另些物质则被选择性的拦截，从而使溶液中不同组分，或混和气体的不同组分被分离,这种分子级的分离称为膜分离。
12、电泳：在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。
13、分光光度技术：利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法二、简答题1、现代生物制药下游技术包括哪些内容1.生物反应器及大规模细胞培养2.生物细胞破碎技术3.生物分子的分离纯化技术4.生物分子含量检测技术5.生物分子鉴定技术6.生物分子活性检测技术2、基因工程基本操作过程包括目的基因的制备、基因载体的选择、DNA重组、DNA重组体的转化、重组体的筛选和鉴定、外源基因的表达3、生物化学样品制备特点⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
⑸为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多阶式”进行（常说逐层剥皮式）。
常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种分离方法，才能达到纯化目的4、生化分离制备实验设计基本思路⑴确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
⑵建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。
⑶通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。
⑷生物材料的破碎和预处理。
⑸分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
⑹生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
⑺产物的浓缩，干燥和保存。
5、蛋白质盐析的原理及优缺点原理：蛋白质是由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的，在水中蛋白质折叠后，由亲水性氨基酸与周围的水分子形成水化膜，因此，蛋白质在水溶液中的溶解度是由它周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，盐对水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，在蛋白质溶液中加入盐后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，实际上是一个去水化的过程。
优点：操作简单成本低廉适用范围广环境温和不易造成蛋白质失活缺点：分辨能力差 .纯化倍数低沉淀中含盐分较多6、离心操作时应注意哪些事项1、首先应根据实验需求选择合适的转子和转速，不要超过转子和离心机限定的最高转速。
2、使用各种类型的离心机都应该在托盘天平上精确配平，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，配平后对称放置在转子中。
3、装载溶液时，要根据转速和液体性质选择合适的离心管，确保离心管能承受住，仔细观察离心管有无裂痕或沙眼，以免离心时液体渗出；如液体进入转子造成离心机腔内污染，应立即将之取出，擦拭干净。
4、若要在低于室温的温度下离心时。
转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。
5、启动离心程序后要等离心机达到预设转速平稳运行后才能离开离心机；如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。
7、举出4种以上的细胞破碎方法及其特点高压匀浆法：可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌高速珠磨法: 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难喷雾撞击破碎：细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎程度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象。
细胞破碎程度可通过无级调节载气压力（流速）控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器的回收。
超声破碎:对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作化学渗透：优点（与机械法相比）:对产物释出具有一定的选择性；细胞外形保持完整,碎片少,有利于后分离；核酸释出量少,浆液黏度低,便于进一步提取。
缺点：时间长,效率低；化学试剂去除困难且具有毒性；通用性差。
酶溶法: 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。
优点：专一性强，发生酶解的条件温和，缺点:酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。
渗透压冲击法: 破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结- 融化法: 将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。
对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。
但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。
另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。
8、凝胶过滤层析的原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定物质的分子量。
一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
9、离子交换层析的原理，举例说明原理:是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析纯化血清蛋白质血清中的白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白（血清白蛋白等电点为pH4.9，α及β球蛋白等电点都小于6、γ-球蛋白pl约为7.3）10、控制膜污染的注意事项1、膜材料的选择：膜的亲疏水性、电荷性会影响到膜与溶质间相互作用大小，亲水性膜和膜材料电荷与溶质电荷相同的膜较耐污染。
2、膜孔径或载留分子量的选择：待分离物质的尺寸大小与膜孔相近时，极易产生堵塞作用。
3、膜结构选择：选择不对称孔径的中空纤维超滤膜，用反洗可解决堵塞问题。
4、溶液pH控制：调pH值远离被分离蛋白质等电点。
5、溶液中盐浓度的影响：无机盐直接对膜影响，无机盐影响蛋白质的溶解性。
6、溶液温度影响：温度升高有时有利于超滤，有时不利于超滤。
7、溶质浓度，料液流速与压力的控制11、电泳的主要类型及作用自由电泳法:是指在溶液中进行的电泳，不用支持物。
在移动界面电泳中，混合物的不同组成成分显示在相对应的运动区域内，而这些运动区域是一个一个部分地重叠着。
该法可以确定带电物质的迁移率，并且能用来研究混合物的组成成分，但是它不能用来分离混合物，也不适用于研究低分子量的物质，主要用于蛋白质系统等生物大分子的研究方面。
区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。
12、画制电泳图谱13、分光光度法测定蛋白质的方法Lowry法：是将双缩脲试剂和Ｆolin试剂即磷钼酸—磷钨酸试剂一并加入到蛋白溶液中，蛋白质发生两步反应：一是肽键与碱性硫酸铜发生双缩脲反应；一是蛋白质中的色氨酸和酪氨酸残基与Ｆolin试剂也发生颜色反应，两个反应结果使反应液颜色更深（深蓝色)。
反应产物在660nm处测定光密度值，然后在标准曲线图上即查得所测样品中蛋白质浓度。
紫外吸收法：蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸含有共轭双键，在280nm处对紫外光具有最大吸收值，且在一定程度上,吸收程度与浓度成正比,利用这一性质，可测定蛋白质的浓度。
实验中，核酸在紫外区也有很强的吸收能力，可通过校正加以消除。
（一）280nm直接检测法：直接测定标准蛋白质溶液和未知蛋白质溶液在波长280nm处的光密度，然后应用下列公式进行计算得出未知蛋白质溶液的浓度。
（二）标准曲线法（三）280nm和260nm的吸收差法：由于核酸在280nm处也有吸收，从而会干扰蛋白质的测定，同时测定280nm 和260nm的光密度值，然后算出蛋白质的浓度。
1.45×OD280nm-0.74×OD260nm=蛋白质浓度（mg/mL）Bradford检测法：是蛋白质与考马斯亮兰（G-250）结合反应，产生红色至蓝色的有色化合物，当G-250单独存在时为红色，当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。
所形成的复合物在595nm处有特异的吸收，因此，可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白含量。