主要荧光素一览表
几种常见荧光素极其特性介绍
荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。
4、其它荧光素
单激光束三色荧光分析时，要求单激光激发，所选择的三种荧光素的发射光波长应该有所不同。除FITC（发射绿光）、PE（发射橙光）外，还应选择发射红光或深红光的藻红蛋白－花青素（phycoerythrin and cyanidinPC5)、叶绿素蛋白（peridinin chorophyll protein，PerCP）或藻红蛋白－德克萨斯红（phycoerythrin and Texas Red tandem，ECD）。因为这些荧光素在受到488nm的蓝光激发CD是由在空间结构上互补的两个荧光素分子通过共价键结合而成，组成一个荧光分子。PC5由PE和cyanidin 5组成，ECD由PE和Texas Red组成。他们前一个分子的发射光波谱与后一个分子的激发光波谱相重合，这样，当前一个分子受激光激发后，产生的发射光可直接激发后一个分子，最后由后一个分子的发射光体现出整个组合的荧光特性。因此，此组成上说是两个分子，但表现为一个分子的物理性质。
（2）PerCP是从一种生活于深海区域的鞭毛虫中发现的色素，其功能为将可渗透入深海的落光传递至鞭毛虫的叶绿素发色基团，进而发出红光。需注意的是PerCP为单个分子。
（3）别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）和花青素5（cyanidin 5，Cy5）这两种荧光素的激发光波长要求在630nm左右，需第二根激光来激发。
常见荧光素
常见荧光素：（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
（2）四乙基罗丹明(rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。
（3）四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。
最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。
（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。
Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。
流式细胞分析中的荧光素你选择对了吗？
流式细胞分析中的荧光素你选择对了吗？流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利⽤流式细胞仪进⾏的⼀种单细胞定量分析和分选技术。
流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电⼦计算机科学等⾼度发展及综合利⽤的⾼技术产物。
当前，流式细胞分析已成为科研发展的⼀个热点，它应⽤⼴泛，主要⽤于：1.测定细胞内 DNA 的变异系数2.DNA 倍体分析3.借助于荧光染料进⾏细胞内蛋⽩质和核酸的定量研究4.快速进⾏细胞分选和细胞收集5.医学应⽤：免疫功能研究各种⼲细胞的检测，癌症病⼈的多药耐药性，细胞功能及代谢动⼒学研究，⾎⼩板分析（⼼⾎管疾病），流式细胞术与分⼦⽣物学研究6.应⽤于外周⾎内⽪细胞测定、调节性 T 细胞等尖端领域流式技术借助于荧光染料进⾏细胞内蛋⽩质和核酸的定量研究，正是科研中所应⽤的重要技术之⼀。
⽽荧光素则⾸当其冲成为科研⼈员荧光标记研究的选择。
常⽤的荧光素及其特性1.藻红蛋⽩（PE）R-PE/B-PE：是⽤于⽣物学检测的超灵敏荧光染料。
它们⽐传统的有机荧光团灵敏度⾼ 100 倍。
其标记的抗体适⽤于所有配备 488nm 氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE的最⼤发射波长为 575nm，在流式细胞仪的 FL2 通道检测。
产品货号 Cat#25562.PE-TexasRedPE-Texas Red 是流式细胞仪中常⽤的的试剂。
是由 PE 和 TexasRed（TR）组合⽽成的 Tandem 荧光素。
其主要吸收峰位于 565nm，发射峰位于 600nm。
其标记的抗体适⽤于所有配备 488nm 氩离⼦激光器的流式细胞仪；PE-TR 的最⼤发射波长为615nm，在流式细胞仪的 FL3 通道检测。
产品货号 Cat#26193.碘化丙啶（PI）碘化丙啶（PI）属于与溴化⼄锭相同的化学类别。
与溴化⼄锭的情况⼀样，其与荧光结合后的荧光增强 20-30 倍。
荧光激发最⼤值红移 30-40nm，荧光发射最⼤蓝移15nm 左右。
常见荧光染料及用途
常见荧光染料及用途《常见荧光染料及用途》荧光染料是一种能够吸收可见光或紫外光，并在吸收能量的激发下发射可见光的化学物质。
它们的应用非常广泛，涵盖了许多领域，例如生物医学、材料科学、环境监测等。
以下介绍几种常见的荧光染料及其主要用途。
1. 墨水蓝(BR)：墨水蓝是一种具有强烈蓝色荧光的染料，常用于生物实验中的DNA染色。
它与DNA结合后能发出强烈的荧光信号，从而在实验中方便地观察和分析DNA的存在和定位。
2. 罗丹明B(RhB)：罗丹明B是一种红色荧光染料，广泛用于组织切片和细胞染色。
它能够与细胞核和胞浆中的核酸结合，以显示细胞和组织的结构，帮助科研人员研究细胞分裂和组织结构变化。
3. 草酸罗丹明G(OG)：草酸罗丹明G是一种绿色荧光染料，主要应用于蛋白质和核酸的定量分析。
在分光光度计中配合荧光检测器使用，可以精确测定溶液中蛋白质和核酸的浓度。
4. 罗丹明110(Rh110)：罗丹明110是一种黄绿色荧光染料，常用于细胞活性检测。
通过与细胞内的酶或细胞膜结合，罗丹明110可以用来评估细胞的活力和存活情况，特别适用于细胞毒性测试和细胞增殖研究。
5. 荧光素(FITC)：荧光素是一种与生物相容性极高的荧光染料，常用于免疫染色和分子生物学实验。
它能与抗体特异性结合，在免疫组化和流式细胞术中用于检测蛋白质的表达以及细胞表面标记。
以上只是常见的荧光染料中的几种，它们的应用还远不止于此。
随着科学技术的不断进步，新型的荧光染料不断问世，为各个领域的研究提供了更多更有力的工具。
通过荧光染料的运用，科学家们能够更好地理解和研究生物、物质和环境，进一步推动科学的发展。
医学检验职业资格考试知识总结—免疫(下)
医学检验职业资格考试知识总结—免疫（下）荧光免疫技术1、概述①荧光色素：能产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物②主要的荧光物质（一）异硫氰酸荧光素（FITC）：显黄绿色荧光（二）四乙基罗丹明（RB200）:显橘红色荧光（三）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：橙红色荧光（四）藻红蛋白（R-RE）：橙色荧光③其他荧光物质（一）镧系螯合物：以EU3+应用最广泛，最适用于时间分辨荧光免疫测定2、荧光抗体技术①以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，标记的抗体应具有高特异性、高亲和力②荧光抗体保存：最好小分量分装保存，4℃可存1-3天3、荧光免疫分析类型①荧光免疫技术包括：荧光抗体技术和荧光免疫测定分析技术②时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）（一）原理：是用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光发热特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行分析，能有效排除非特异荧光的干扰，极大提高分析灵敏度（二）常用标记物：EU3+③荧光酶免疫测定（一）原理：利用酶标抗原或抗体，与待测抗原或抗体反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量（二）常用酶标物：碱性磷酸酶（三）常用的荧光底物：4—甲基伞酮磷酸盐（4—MUP）（四）方法类型：双抗体夹心法、双抗原夹心法、固相抗原竞争法4、荧光免疫技术的临床应用①主要临床应用（一）自身抗体检测（二）病原体检测（三）免疫病理检测（四）细胞表面抗原、抗体检测（五）流式细胞仪技术酶免疫技术1、酶免疫技术特点①原理：将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫技术，是将酶与抗原或抗体结合成酶标抗体或抗原，即保持了免疫性又有催化作用；在酶标抗体或抗原与抗原或抗体的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性、定量分析②常用酶及相应底物（一）辣根过氧化物酶（HRP）：在蔬菜作物中提取底物：邻苯二胺（OPD），四甲基联苯胺（TMB）（二）碱性磷酸酶（ALP）：从牛黏膜或大肠杆菌中提取底物：对硝基苯磷酸脂（P-NPP）（三）β—半乳糖苷酶:常用于均相酶免疫测定底物：4—甲基伞酮基—R—D半乳糖（4—MUU）③固相载体（一）板上：结合抗体或抗原的容量大，可将抗原或抗体牢牢固定在其表面，经长期保存和多次洗涤也不易脱落（二）包被：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程（三）封闭：防止非特异性反应，用1%—5%小牛血清白蛋白2、酶免疫技术的分类①酶免疫测定（一）用于液体标本中抗原或抗体的定性或定量（二）根据抗原抗体反应后是否将结合游离的酶标志物分离，酶免疫测定分为均相和异相两种类型如：Ab+E→Ab-E （游离酶标抗体）Ab-E+Ag→Ab-E-Ag（复合物）Ab—抗体E—酶Ag—抗原②均相酶免疫测定（一）原理：利用Ab-E结合Ag形成Ab-E-Ag复合物后，标记酶的活性会发生改变，可以在不将Ab-E-Ag与Ab分离情况下，通过直接测定系统中总的标记酶活性改变，即可确定Ab-E-Ag的形成，进而检测出样品中Ag的浓度③异相酶免疫测定（一）分离Ab-E-Ag复合物和单纯酶标物（Ab-E），来测定Ab-E-Ag复合物中酶活性，进而检测出Ag浓度（二）分为液相和固相酶免疫测定两类A：异相液相酶免疫测定：主要用于检测样品中极微量的激素或药物B：异相固相酶免疫测定：常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）3、酶联免疫吸附试验（ELISA）①基本原理（一）抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫性（二）将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，即保留免疫活性，又保留了酶活性（三）测定时将受检样品和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上抗原或抗体反应，形成复合物（四）用洗涤方法分离结合与游离的酶标抗体或抗原（五）加入底物显色②方法类型及反应原理（一）三个必要试剂：固相抗原或抗体、酶标抗原或抗体、酶反应底物（二）抗原测定方法Ⅰ：双抗体夹心法A：双抗体夹心法只适用于二价或二价以上的大分子抗原测定，形成固相抗体—待测抗原—酶标抗体复合物B：常用于乙肝表面抗原、甲胎蛋白、HCG等检测Ⅱ：双位点一步法A：主要针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的单克隆抗体，即包被使用一种单抗体，酶标记使用另一种单抗体Ⅲ：竞争法A：主要用于测定小分子抗原B：先用抗体包被固相载体上，然后同时加入待测抗原和酶标抗原，待测抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合，温育、洗涤、加酶底物显色（三）抗体测定方法Ⅰ：间接法A：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本，使样本中待测抗体与固相载体上抗原结合，再加入酶标二抗，在固相载体上形成固相抗原—待测抗体—酶标二抗复合物，加入底物显色B：常用于丙型肝炎抗体测定、人类免疫缺陷病毒抗体等Ⅱ：双抗原夹心法A:适用于大分子抗体，具有两个及以上的接触位点，原理同双抗体夹心法B：常用于乙型肝炎表面抗体的测定Ⅲ：竞争法A：主要检测小分子抗体B：常用于乙型肝炎核心抗体、e抗体的检测IV：捕获法A:主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgG、lgM、lgA等）的测定，目前最常用的是病原体急性感染诊断中的lgM型抗体B：将抗lgM抗体包被在固相载体上，加入待测lgM抗体，特异性结合化学发光免疫技术1、概述①化学发光：指伴随化学反应过程，所产生的光的发射现象②发光：指分子、原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再回到基态并释放光子的过程2、化学发光免疫分析由两个系统组成①化学发光系统：利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态中间体，当这种激发态中间体回到基态时，同时发射出光子，利用光信号测量仪器测量光量子②免疫反应系统：将发光物质直接标记在抗原或抗体上3、直接发光剂①在发光免疫分析过程中，不需要酶的催化作用②包括：吖啶酯和三联吡啶钌4、酶促反应发光剂①利用标记酶的催化作用，使发光剂发光②目前标记酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶5、化学发光免疫分析类型①直接化学发光免疫分析：常用吖啶酯②化学发光酶免疫分析③电化学发光免疫分析：常用三联吡啶钌免疫细胞的分离及其表面标志检测技术1、免疫细胞的分离①外周血单个核细胞分离（一）2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液与1份34%泛影葡胺生理盐水溶液混合，可作为淋巴细胞分离液，即Ficoll分离液（二）Ficoll分离液主要用于外周血单个核细胞分离，由上到下为：稀释血浆层、单个核细胞层、粒细胞层、红细胞层（三）从外周血分离得到的纯淋巴细胞群，再分离T、B淋巴细胞，常用方法：E花环沉降法、尼龙毛柱分离法、亲和板结合分离法（四）分离细胞的保存及活力测定A：短期保存：4℃B：长期保存：液氮深低温（-196℃）环境保存，加入二甲亚砜作为保护剂C：活力测定最常用：台盼蓝染色法；死细胞着色，活细胞不着色2、T淋巴细胞标志及亚群分类①T细胞表面标志及其亚群（一）所有T细胞均有共同的标志性抗原：CD3（二）辅助性T细胞（Th）：CD3+、CD4+、CD8-（三）杀伤/细胞毒性T细胞（TC或CTL）：CD3+、CD4-、CD8+（四）调节性T细胞（Tr）：CD4+、CD25+②T细胞表面主要的CD抗原（一）CD2：是T细胞与NK细胞共有，又称“绵羊红细胞受体”（二）CD3：全部T细胞表面都有（三）CD4/CD8：区分T细胞亚群重要标志；CD4主要为Th，CD8主要为TC（四）T细胞表面识别受体TCR③辅助性T细胞（Th）（一）Th1：主要分泌IL-2、IFN-α、TNF-β等细胞因子，辅助细胞免疫，参与迟发型超敏反应（二）Th2：主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，辅助体液免疫，参与速发型超敏反应④T细胞表面受体：抗原受体、绵羊红细胞受体、细胞因子受体、lgFc受体、丝裂原受体、E受体3、B淋巴细胞表面标志①B细胞表面受体：膜免疫球蛋白（Smlg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体（一）膜免疫球蛋白（Smlg）：又称BCR，是B细胞最具有特征的表面标志（二）Smlg主要作用结合特异性抗原，也叫抗原受体（三）成熟B细胞的Smlg主要为SmlgM和SmlgD②人T细胞与B细胞区别在于lg表面标志，T细胞与B细胞表面共有标志是PWM-R③成熟B细胞表达：CD10、CD19、CD20、CD21、CD22（一）成熟B细胞均表达CD19（二）根据有无CD5表达可分为：B1淋巴细胞（表达CD5）和B2淋巴细胞（不表达CD5）4、NK细胞表面标志①NK细胞表面标志：CD16、CD565、淋巴细胞功能检测①T淋巴细胞功能检测：H-TdR掺入法②B淋巴细胞功能检测：溶血空斑试验③NK细胞功能检测：酶释法6、其他免疫细胞①抗原提呈细胞（APC）（一）概念：摄取、加工、处理抗原，并将抗原提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞（二）APC分类A:专职APC：包括巨噬细胞、树突状细胞、B细胞它们均表达MHC-Ⅱ类分子B：非专职APC：包括内皮细胞、激活T细胞等②单核—吞噬细胞（一）包括骨髓内的单核细胞、外周血中单核细胞、组织内的吞噬细胞（二）典型表面标志：CD14③树突状细胞（DC）（一）主要来源：骨髓粒系和淋巴系（二）成熟DC主要表面标志：CD83、CD1、CD117、淋巴细胞表面标志检测的临床意义①在评价免疫功能时常采用CD4/CD8的比值②CD4是HIV受体，CD4/CD8会下降③CD4/CD8上升见于自身免疫性疾病；CD4/CD8下降见于病毒感染、恶性肿瘤、再障等免疫细胞功能检测1、免疫细胞大致分两类①一类能识别特异性抗原，一旦被激活则显示出特异性应答功能，主要是淋巴细胞②另一类能捕获抗原，处理抗原，从一定方式提呈给淋巴细胞，主要是吞噬细胞、树突状细胞2、各免疫细胞的功能检测①中性粒细胞功能检测：硝酸四氮唑蓝还原试验（NBT）②吞噬细胞功能检测：炭粒廓清试验③B细胞功能检测：溶血空斑试验④T细胞功能检测：淋巴细胞转化试验⑤NK细胞功能检测：酶释法流失细胞分析仪技术1、概述①基本原理（一）检测的是单个细胞（二）检测的是细胞内或细胞外附着的分子（三）流式就是被检测细胞排成队，一个挨一个通过检测系统，根据细胞附着分子染色的不同，而被检测出来如：T淋巴细胞表面CD3被染成红色，B淋巴细胞表面CD20被染成绿色②流式细胞仪组成（一）由液流系统、光学系统、信号转换测试系统、信号处理的计算机系统组成，可对细胞悬液中的单个细胞、特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析（二）液流系统：样本、鞘液组成（三）光学系统：激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组、滤片、光电倍增管（四）数据处理系统：计算机及软件组成③细胞分选原理（一）在实验时设定了被分选细胞的特性参数，当系统一检测到此参数时，就让此细胞落入指定的收集器中，完成细胞分选目的2、数据的显示与分析①流式细胞仪收集细胞产生各种电讯号，最终以数字及图式形式表示②免疫分析中常用的荧光染料与标记染色（一）异硫氰酸荧光素（FITC）：亮绿色荧光（二）德州红：红色荧光（三）藻红蛋白（PE）：橙黄色（四）碘化丙啶（PI）：橙红色（五）别藻青蛋白（APC）：红色（六）多甲藻黄素叶绿素蛋白：深红色③免疫胶乳颗粒技术（一）对于细胞上附着的可溶性分子，可以把可溶性分子标志在颗粒上，然后形成细胞—颗粒—可溶性分子进行检测④光信号（一）发射光波长与激发光波长间有较大波长差，荧光染料对488nm激发光有强吸收（二）侧向角散射光信号与细胞内颗粒复杂程度有关，急内部结构（三）前向角散射光信号与细胞大小有关体液免疫球蛋白测定1、概述①免疫球蛋白（lg）是由浆细胞合成和分泌的一组具有抗体活性的蛋白质，按其重链分lgG、lgA、lgM、lgD、lgE②免疫球蛋白亚型（一）lgG有4个亚型：lgG1、lgG2、lgG3、lgG4（二）lgA有2个亚型：lgA1、lgA2和分泌型lgA（三）lgM有2个亚型：lgM1、lgM22、血清lgG、lgA、lgM、lgD、lgE测定①血清lgG（一）lgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，其中以lgG1含量最多（二）lgG是血液和组织外液中的主要抗体（三）是机体再次免疫应答的主要抗体（四）可通过胎盘（五）大多数抗感染抗体和自身抗体都为lgG②血清lgA（一）由血清型和分泌型两种（二）是参与黏膜局部免疫的主要抗体，主要是胃肠道、初乳、唾液、泪液、支气管等感染（三）分泌型lgA与骨质破坏的严重程度有关③血清lgM（一）是分子量最大的lg，又称巨球蛋白（二）为五聚体（三）是个体中最早合成和分泌的抗体（四）体液免疫中最早产生的抗体（五）感染期lgM水平升高，说明近期感染；lgG升高，说明后期感染（六）新生儿脐血中lgM增高，提示宫内感染④血清lgD（一）膜结合型lgD构成BCR，是B细胞分化发育成熟的标志（二）未成熟B细胞仅表达mlgM，成熟B细胞可同时表达mlgM和mlgD⑤血清lgE（一）lgE是正常人血清中含量最少的lg（二）lgE为亲细胞抗体，可引起Ⅰ型超敏反应（三）lgE与机体抗寄生虫有关（四）lgE升高常见于系统性红斑狼疮（SLE）；降低见于原发性无丙种球蛋白血症、肿瘤及化疗药物后3、尿液及脑脊液lg测定①尿液lg测定及临床意义（一）正常人尿液中lg含量甚微，当肾小球滤过膜轻微损伤时，尿中以lgG增多为主；严重损伤时lgG增多外，大分子量lgM也增多（二）临床上常用尿液和血液中的转铁蛋白（TRF）及lgG含量来计算选择性蛋白尿指数（SPI），来评估肾小球滤过膜破坏程度SPI=（尿lgG/血lgG）/（尿TRF/血TRF）SPI≤0.1表明肾脏有高度选择性的排泌分子量较小的蛋白质，此时损伤较小SPI≥0.1表明肾脏是非选择性排泌分子量较大蛋白质，损伤较严重②脑脊液lg测定及临床意义（一）lgG、lgA、lgM在脑脊液中浓度依次递减（二）临床主要通过测定白蛋白商值，来反映脑屏障受损程度（三）脑脊液lgG升高，见于化脓性脑膜炎、脑血管疾病等4、M蛋白测定及临床意义①M蛋白：是B淋巴细胞或浆细胞单克隆异常增殖所产生的异常单克隆免疫球蛋白，多无免疫活性②检测M蛋白方法（一）筛选M蛋白最基本方法：血清蛋白区带电泳技术（二）M蛋白的初筛试验：血清免疫球蛋白定量测定（三）鉴定M蛋白最常用方法：免疫固定电泳③临床意义（一）临床上多用于多发性骨髓瘤、高丙种球蛋白血症5、轻链球蛋白测定及意义①本—周蛋白（一）本—周蛋白：尿中游离的免疫球蛋白轻链（二）检测方法：化学法（加热沉淀法）和免疫法（三）检测本—周蛋白对轻链病的诊断是必不可少的，常见于多发性骨髓瘤（四）本—周蛋白分子量很小，极易迅速由肾脏排出，血中反而阴性6、冷球蛋白检测①冷球蛋白：又称冷免疫球蛋白，是一组在低温下发生沉淀，加热后复溶的免疫球蛋白，一般在4℃时发生沉淀，37℃时复溶②冷球蛋白分型（一）Ⅰ型：为单克隆冷球蛋白型，最常见lgM增高，多见于恶性疾病，如肿瘤、多发性骨髓瘤（二）Ⅱ型：单克隆和多克隆混合型冷球蛋白，常见lgM，偶见lgG，多见于恶性疾病前期，如自身免疫性疾病（三）Ⅲ型：多克隆混合型冷球蛋白补体检测1、概述①补体：是一组存在人和脊椎动物血清中具有酶样活性，不耐热的糖蛋白②补体成分含量与理化特征（一）补体成分含量A：补体大多数为糖蛋白，属于β球蛋白B：正常血清中补体含量最高的是C3，含量最少的是C2（二）补体理化特征A：灭活条件，加热56℃30minB：补体性质不稳定，具有酶阳活性③补体的活化途径（一）经典途径（二）旁路途径（三）MBL途径2、补体总活性测定①CH50测定原理（一）补体最主要活性是溶细胞作用（二）溶血反应对补体剂量呈S形曲线（三）实验常以50%溶血作为终点指标（四）在补体参与的溶血实验中，应使用2个单位的溶血素②补体活性检测方法（一）基于经典途径的CP—CH50和应用于C3旁路途径检测AP—CH50（二）CP—CH50是临床常规进行的补体总活性检测项目3、单个补体成分测定①30多种补体中C1、C3、C4、B因子常作为单个补体成分检测指标②测定方法（一）免疫溶血法：检测单个补体的活性（二）血清学法：检测单个补体含量A：免疫溶血法：根据抗原与其特异性抗体结合可激活补体经典途径导致细胞溶解B：免疫化学法：透射比浊法、散射比浊法4、补体结合试验（CFT）①补体结合试验：由反应系统、指示系统、补体系统三大系统组成，主要是利用补体的溶血作用进行抗原、抗体检测②反应系统：用已知抗原或抗体来检测相应抗体或抗原，多采用方阵法进行滴度，选择抗原、抗体最适比例，呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价③指示系统：免疫溶血机制④临床应用（一）用于华氏反应检测梅毒（二）HLA分型的补体依赖性细胞毒试验超敏反应性疾病及其免疫检测1、概述①超敏反应：又称变态反应，指机体对某些抗原初次应答致敏后，再次接触相同抗原刺激时，所出现的一种生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的异常免疫应答②超敏反应包括：Ⅰ型超敏反应、Ⅱ型超敏反应、Ⅲ型超敏反应、Ⅳ型超敏反应2、各型超敏反应特征及临床意义①Ⅰ型超敏反应（一）由特异性lgE抗体介导产生，其发生速度最快，又称速发型超敏反应（二）发生机制A：变应原：某些药物，如青霉素；花粉、食物，如奶等B：抗体：特异性lgE抗体，称为变应素C：细胞参与：肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞（三）发生过程A：致敏阶段：当变应原首次进入机体，可选择性诱导B 细胞产生lgE抗体，使机体对该变应原致敏状态B：激活阶段：处于致敏状态的机体，再次接触相同变应原C：效应阶段：根据效应作用发生的快慢和持续时间长短（四）Ⅰ型超敏反应免疫学检查A：皮肤试验，阳性呈红晕、红斑、瘙痒②Ⅱ型超敏反应（一）又称细胞毒型或细胞溶解型超敏反应（二）是由靶细胞表面的抗原与相应lgG或lgM抗体结合后，在补体、巨噬细胞、NK细胞参与下，引起以细胞溶解或组织损伤为主的病理性免疫反应（三）常见Ⅱ型超敏反应性疾病A：输血反应B：新生儿溶血症C：自身免疫性溶血性贫血D：血小板减少性紫癜E：格雷夫斯病（Graves病）③Ⅲ型超敏反应（一）又称免疫复合型或血管炎型超敏反应（二）由可溶性免疫复合物沉积于局部或全身多处毛细血管基底膜，通过激活补体并在血小板、中性粒参与下，引起充血性水肿、局部坏死、中性粒细胞浸润为主要特征的炎症反应和组织损伤（三）发生机制A：中等大小免疫复合物的形成B：可溶性复合物沉积C：免疫复合物沉积引起免疫组织损伤（四）临床意义A：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等④Ⅳ型超敏反应（一）又称迟发型超敏反应（二）是效应T细胞与特异性抗原结合后，引起以单个核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应（三）发生机制A:抗原主要是胞内寄生菌、病毒、寄生虫等B：效应T细胞主要是：CD4+和CD8+细胞（四）常见疾病A：结核菌素反应、传染性超敏反应、接触性皮炎、移植排斥反应自身免疫性疾病及其免疫检测1、概述①自身免疫：指某些情况下，机体免疫系统对自身成分发生免疫应答，多数情况下病因不清楚②自身抗原：一系列生物、物理、化学因素引起自身组织结构与成分发生改变，并能引起机体免疫系统针对这些组织细胞成分产生免疫应答反应2、常见自身免疫性疾病①由Ⅱ型超敏反应引起自身免疫性疾病（一）自身免疫性溶血性贫血（二）免疫性血小板减少性紫癜②自身抗体—免疫复合物引起的自身免疫性疾病（Ⅲ型超敏）（一）系统性红斑狼疮（SLE）（二）类风湿性关节炎（三）干燥综合征③T细胞对自身抗原应答引起的自身免疫性疾病（Ⅳ超敏反应）（一）Ⅰ型糖尿病（二）多发性硬化症3、常见自身免疫性疾病的自身抗体检测①抗核抗体（ANA）（一）指将自身真核细胞的各种细胞成分作为靶细胞（二）ANA分类A：抗DNA抗体B：抗组蛋白抗体C：抗核仁抗体D：抗非组蛋白抗体（三）目前常用间接免疫荧光法作为ANA筛选试验②抗中性粒细胞浆抗体（ANCA）（一）分型：胞浆型（CANCA）和核周型（PANCA）（二）特异性ANCA检测最常用ELISA法③抗线粒体抗体（AMA）（一）常用间接免疫荧光法检测4、常见疾病对应的自身抗体检测①临床常见（一）重症肌无力：AchR阳性（乙酰胆碱）（二）干燥综合征：抗SSA抗体、抗SSB抗体（三）原发性胆汁性肝硬化：抗线粒体型（四）Ⅰ型自身免疫性肝炎：抗平滑肌抗体（五）进行性系统性硬皮症（PSS）：抗SCl—70抗体（六）多发性肌炎：抗Jo—1抗体（七）强直性脊柱炎：HLA—B27（八）痛风性关节炎：尿酸（九）风湿性关节炎：ASO（抗链球菌溶血素）（十）类风湿关节炎：抗CCP抗体、抗lgG抗体、类风湿因子（RF）、抗角蛋白抗体（AKA）免疫缺陷性疾病1、概述①免疫缺陷：由遗传因素或其他原因造成的免疫系统发育或免疫应答障碍，从而导致的一种或多种免疫功能不全2、常见免疫缺陷疾病①获得性免疫缺陷综合征（AIDS）（一）又称艾滋病（HIV）（二）患者以CD4+T细胞减少为主要特征（三）常用ELISA法检测HIV的核心抗原P24，该抗原主要出现在急性感染期和晚期（四）初筛试验：ELISA、乳胶凝集法、免疫层析法（五）确诊试验：免疫印迹法（IBT）②Bruton综合征（一）是原发性B细胞免疫缺陷（二）检测方法：免疫球蛋白检测③Di—George综合征（一）是原发性T细胞免疫缺陷（二）检测方法：淋巴细胞增殖反应试验④慢性肉芽肿（一）是原发性吞噬细胞缺陷（二）检测方法：粘附分子测定肿瘤免疫与免疫学检验1、肿瘤抗原①定义：指在肿瘤发生、发展过程中新出现的或过度表达的抗原物质②肿瘤特异性抗原：是肿瘤细胞所持有的新抗原，它只表达于肿瘤细胞而不存在于正常组织细胞③肿瘤相关性抗原：指非肿瘤细胞所持有，正常细胞或组织可表达的抗原物质，但此类抗原在癌变细胞的表达水平远远超过正常细胞2、抗肿瘤的细胞免疫机制①参与抗肿瘤免疫的细胞主要是：T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞3、肿瘤免疫学检验①肿瘤标志物：指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者由机体对肿瘤细胞反应所产生，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶、多胺、癌基因产物4、常见肿瘤标志①胚胎抗原类标志物（一）甲胎蛋白（AFP）升高见于原发性肝癌、病毒性肝炎、肝硬化（二）癌胚抗原（CEA）升高见于结肠癌、肠道息肉、直肠癌（三）鳞状细胞癌抗原（SCC）见于子宫颈癌②糖链抗原类（一）CA153：多见于乳腺癌（二）CA125：多见于卵巢癌（三）CA199：多见于胰腺癌、又与胃肠癌相关（四）CA724：多见于胃癌③酶类（一）前列腺特异性抗原（PSA）：多见于前列腺癌（二）神经元特异性烯醇化酶（NSE）：多见于小细胞肺癌、神经内分泌肿瘤。
流式配色及分析
如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。
精选2021版课件
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胞内因子的含量与检测效果
如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。
开源：刺激活化T细胞。方法有二：
1:PMA（PHA/LPS...)＋Ionomycin: PMA能自由透过细胞膜，因此能绕过细胞膜受体直接激活PKC; Ionomycin则能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高； 只有PMA+Ionomycin联合应用才是使T细胞进入细胞周期的最有效的方法.
流式配色分析及实验设计
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1
关于流式抗体
什么是荧光素
fitc pe
✓ 荧光素是具有荧光特性的染料 ✓ 只在特定波长激光照射后才发出自身荧光 ✓ 发出的精选荧20光21版颜课件色（波长）也是固定的 2
流式细胞技术：
在细胞分子水平上； 通过单克隆抗体； 对单个细胞或其他生物粒子； 进行多参数； 快速的； 定量分析。
红3
Pe-cy7
远红 4
Apc(AF647,ef660) 红 5
Apc-cy7(ApcH7,ef780)
远红 6
可以也仅可以最多选择8个荧光抗体去标 记抗原；
需要注意： 同一通道不可以选2种荧光抗体，例如： AF488，BB515,FITC 不可以同时使用；
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19
染料的亮度与抗原表达强度相匹配
Tertiary: 低水平表达，激活性marker，或者表达区 分不明显
Example: CD25
CD4 CD45RA
CD25
几种常见荧光素极其特性介绍
几种常见荧光素极其特性介绍荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。
荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。
目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。
下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性：1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。
是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
2、藻红蛋白，简称“PE”。
相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。
但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。
需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。
3、PI和EB。
两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。
为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。
PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。
PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。
另外，PI比EB测得的DNA分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
4、其它荧光素单激光束三色荧光分析时，要求单激光激发，所选择的三种荧光素的发射光波长应该有所不同。
【高中生物】荧光抗体的制备
【高中生物】荧光抗体的制备（一）免疫球蛋白的提取（二）荧光素1．荧光色素的基本条件（1）具有化学活性基团，如异硫氰基（-ncs）等，易与免疫球蛋白结合形成共价键。
（2）对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性。
（3）荧光效应高，与蛋白结合需要量少。
（4）荧光素性能平衡，结合物性能平衡，难储藏。
（5）结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用，易于观察判定。
至目前为止，基本合乎上述建议的荧光素只有异硫氰酸荧光素（fitc），丽丝胺罗丹明b200（rb200）。
2．常用的荧光色素（1）异硫氰酸荧光素：又称异硫氰酸荧光徐，纯品为橙黄色粉末。
棕斑结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度小、平衡、强于粉末型。
分子式c21h11o2n5、分子量389，溶水，易溶于ph8-9.5碳酸盐缓冲液中。
最小稀释波长为495nm。
最小升空波长520nm。
异硫氰酸荧光徐性质平衡，于低温下可以留存二年以上，但久置标记抗体能力强，荧光亮度高，故应使用新产品。
异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸（主要是赖氨酸）的氨基结合。
一个igg分子有86个氨基酸残基，一般最多能标记16～20个荧光素分子。
（2）丽丝胺罗丹明：为褐色粉末，不溶水、易溶于酒精和丙酮。
荧光为桔红色。
性质平衡，可以长期留存。
分子式c23h29o7nas2，分子量为580，最小稀释波长570nm，最小升空波长为600nm。
由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与fitc标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。
此染料不能直接与蛋白质结合，必须先用五氯化磷（pcl5）处理，使染料的-so3na基变为-so3cl基后，才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合，形成稳定的硫氨键。
（三）标记方法异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：1．烘烤法（1）取一定量的纯igg液，用0.5mol/lph9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。
（2）按荧光素与蛋白质比1?20～1?100（通常用1?100）称取异硫氰酸荧光素，用ph9.5碳酸盐缓冲液熔化。
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（1）荧光素类
Fluorescein
标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,可产生一系列荧光素衍生物。
Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。
标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。
与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。
主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。
FITC
异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。
FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。
适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=）。
与蛋白的结合力也强。
FITC具有荧光素衍生物的普遍特性。
在水中易变坏，不能长久保存。
FITC-Oligo 广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。
FAM
羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。
Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。
与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。
FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。
5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。
四氯荧光素，Tetrachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。
TET以及HEX均是在FAM基础上加以改进的，氯原子使FAM的Abs与Em值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了pH敏感性。
TET也适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=521/536nm 。
TET，HEX，FAM和TAMRA可配合用于DNA自动测序中，其中TET用于标记d/ddATP，HEX用于标记d/ddGTP 或d/ddATP（PE公司）
HEX
六氯荧光素，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。
适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=535/556nm。
（请参见TET介绍）
JOE
羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素，Carboxy-4',5'-dichloro-2'，7'-dimethoxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，6-JOE更被广泛使用。
JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。
6-JOE也适合于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=520/548（pH=）
常用于DNA自动测序，标记d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。
（2）罗丹明类（Rhodamine dye）
R 110
标准荧光素（Reference standard）之一,在其基础上进行结构改造,即可产生一系列罗丹明类衍生物。
与Fluorescein类衍生物相比，罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性，更高的荧光产量以及更低的pH 敏感性
罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸，但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭，故大多数不适宜用于标记蛋白。
R110被用于DNA自动测序。
TAMRA
全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，6- TAMRA被广泛使用。
TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的，6- TAMRA适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=547/573nm （Ph=），6-TAMRA（NHS）常用于荧光标记试剂盒中。
6- TAMRA主要用于DNA自动测序中。
Texas Red
Texas Red是一个长波长荧光素,与Fluorescein几乎没有波谱重叠,只适合于Ar-Kr Laser的568nm 光谱线或He-Ne Laser的594光谱线,比Tetramethylrhodamine和LissamineTM Rhodamine B波长更长，荧光量更高。
Texas Red在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记(Third labels)。
（3）BODIPY类
BODIPY类荧光素是由分子探针公司开发，以用来替代那些有部分缺陷的传统荧光素，普遍具有荧光产量高，pH敏感性低（无离子变化），光稳定性强以及发射波谱窄的优点，故BODIPY类荧光素已被广泛用于核酸，，脂肪酸，磷脂以及各种受体。
同时，由于在电泳过程中对序列片段影响小，故已被逐渐用于DNA 自动测序。
但相对而言, BODIPY类荧光素并不特别适合标记蛋白.
BODIPY FL可代替Fluorescein
BODIPY R6G可代替Rhodamine 6G
BODIPY TMR可代替Tetramethylrhodamine
BODIPY TR可代替Texas Red
这些BODIPY类荧光素具有与被替代物几乎类似的光谱特征，能共用同样的光过滤器与激发光源，但更具优点。
（4）其他荧光素
Cascade blue
Cascade blue是在芘 (pyrene)结构基础上改造得来的,即sulfonated pyrene,它是一种短波长紫外激发荧光素,与另一种常用的紫外荧光素Aminocoumarin相比,Cascade blue的Em与Fluorescein有更小的光谱重叠,有更高的荧光吸收和更大的荧光产量. Cascade blue在376nm处存在第二个吸收峰,水中不稳定。
Cascade blue 主要用于标记蛋白,作为极性示踪子(polar tracer)可进行膜蛋白定位等.但也能用于标记核酸和葡聚糖。
Aminocoumarin
一种短波长紫外激发荧光素，通常使用的是7-amino-4-methylcoumarin, 红移现象明显,比Cascade blue有更长的发射波长,肉眼观察明显，更适用于confocal。
表1：主要荧光激发光源
表2：主要荧光素一览表。