鸡卵类黏蛋白的分离纯化

鸡卵类黏蛋白的分离纯化、活性及分子量测定

唐灵杰杨荣燕曹雪文唐威风

河北大学生命科学学院 2013生物工程2班

摘要：本实验的主要目的是掌握鸡卵类黏蛋白（CHOM）的性质及活性测定方法，了解其应用。掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，掌握电泳仪的使用。掌握离心机、分光光度计的使用。

鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶抑制剂，胰蛋白酶能水解酯键,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算类粘蛋白的活力。先通过三氯乙酸-丙酮除去蛋清中的杂蛋白，后经等电点沉淀得到类粘蛋白的粗品；然后经过DEAE纤维素柱层析纯化得到纯品；用Folin-酚法测定粗品和纯品中蛋白质含量，紫外分光光度计测定其抑制活力；最后，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测类粘蛋白的纯度及分子量。

关键词：鸡卵类粘蛋白纯化层析抑制活力分子量

Abstract:The main purpose of this experiment is to grasp the nature and activity of chicken ovomucoid CHOM, and to understand its application.. Master polyacrylamide gel electrophoresis technology, master the use of electrophoresis. Master centrifuge, spectrophotometer use.

Chicken ovomucoid is a kind of specificity strong trypsin inhibitors, can hydrolyze ester keys, amides keys and peptide bond. Use this nature and synthetic substrate or natural protein can determine the vitality of trypsin, so can calculating the vitality of chicken ovomucoid.First, remove the miscellaneous protein in egg white by TCA –acetone, then get the rough protein by isoelectric precipitation.Then after chromatography column packing column, balance, Sample , elution, rebalance etc to achieve the purification of chicken ovomucoid.then we can get the eligibility product from DEAE cellulose column chromatography at last.The contents of protein in crude and pure products were determined by Folin- phenol method, and the inhibition activity was determined by ultraviolet spectrophotometry.Finally, through SDS-page polyacrylamide gel electrophoresis to determine the purity and molecular weight of chicken ovomucoid.

Key words：Chicken ovomucoid Purification Chromatogram inhibitory activity molecular weight

1前言

鸡卵类黏蛋白（ Chicken Ovomucoid, CHOM）是从鸡卵清中分离的糖蛋白，具有强烈抑制胰蛋白酶的的作用，是典型的胰蛋白酶抑制剂，常用于胰蛋白酶及类胰蛋白酶的酶学性质研究。CHOM在pH7.8-8.0的碱性条件下，具有很强的结合胰蛋白酶的活性，而且这种结合是可逆的，因此，可以制成亲和吸附剂，用以纯化胰蛋白酶。

鸡卵类黏蛋白为糖蛋白，在糖蛋白的糖链部分（主要是D－甘露糖、D－半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上有差别，所以，在电泳行为上常呈现不均一性，经常表现为弥散性条带。目前至少已获得四种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶性能上及氨基酸组成上没有多大的区别。

鸡卵类黏蛋白的等电点有一定的范围：大致在pH3.9－4.5，分子量在28000Da。其抑制胰蛋白酶的摩尔比为1：1，1μg高纯度的卵类黏蛋白能抑制相当于0.86 μg的胰蛋白酶（比活力为12000BAEE U/mg）。不同来源的卵类黏蛋白的N-末端残基有很大差异，鸡卵类黏蛋白的N-末端为Ala，C-末端为Phe。

卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的尿素很稳定，在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。鸡卵类黏蛋白对猪、牛的胰蛋白酶强烈抑制，对枯草杆菌蛋白酶有一定程度的抑制，但对人的胰蛋白酶无明显的抑制作用，对胰凝乳蛋白酶也无抑制作用。

2材料与方法

2.1 材料

新鲜鸡蛋、0.05mol/L三氯乙酸溶液（TCA）、丙酮溶液、DEAE-纤维素、 0.2 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液、0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液、0.3mol氯化钠-0.02mol PH6.5磷酸盐缓冲液、0.5 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液、3.0 mL BAEE- 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液、0. 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液、0.0 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液胰蛋白酶、Folin-酚试剂：试剂甲：①4%碳酸钠溶液；②0.2mol/L氢氧化钠溶液③1%硫酸铜溶液；④2%酒石酸钾钠溶液。先将①②等体积混合，再将③④等体积混合，再将这两种混