抑菌试验步骤
305 牛津杯法抑菌试验
牛津杯法抑菌试验1. 原理将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养，一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散，形成递减的梯度浓度。
牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。
2. 仪器、设备2.1 超净工作台2.2恒温培养箱：36±1℃。
2.3恒温水浴锅：50±1℃。
2.4高压灭菌锅。
2.5平皿：直径为9 cm。
2.6 移液器（20~200μL，100~1000μL，1~5mL）及配套无菌枪头。
2.7试管：15×150 mm。
2.8 酒精灯。
2.9试管架。
2.10涡旋混匀器。
2.11摇床：36±1℃。
2.12牛津杯。
3. 病原菌、培养基及其他3.1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。
3.2 抑菌物质：益生菌（乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。
3.3 培养基：（1）大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（2）金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（3）沙门氏菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（4）乳酸菌：MRS肉汤。
（5）芽孢菌：营养肉汤。
3.4 其它：0.85%灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。
4 测定流程4.1病原菌扩培：在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养16-20h。
将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0.30-0.36之间，则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。
4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备：（1）抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。
牛津杯法抑菌试验步骤
牛津杯法抑菌试验步骤
一、准备试剂和器材
试剂：待测试的抑菌剂、无菌水、培养基（如LB、麦芽糖等）。
器材：移液管、无菌棉签、牛津杯、试管、培养箱、天平等。
二、制备菌液
从保存的菌种中取适量菌种，接种于无菌培养基中。
将培养基放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养至菌种生长至对数期。
将培养好的菌液用无菌棉签轻轻涂布于无菌平板上，观察菌落的形态和大小。
用移液管取适量的菌液，制备成一定浓度的菌悬液。
三、准备牛津杯
取一块无菌滤纸片，将其放入牛津杯中，使其贴紧杯壁。
用移液管将适量的抑菌剂加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录抑菌剂的种类和浓度。
四、加样
取适量的测试样品放入无菌试管中。
用移液管将样品溶液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录样品溶液的种类和浓度。
五、加菌液
用移液管将制备好的菌悬液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
轻轻摇晃牛津杯，使菌悬液和样品溶液充分混合。
六、培养
将牛津杯放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察培养结果，记录细菌的生长情况。
七、结果观察
取出生长至对数期的细菌，用无菌棉签涂布于无菌平板上。
将无菌平板放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察细菌的生长情况，记录细菌的数目和形态。
最小抑菌浓度实验步骤
最小抑菌浓度实验步骤嘿，朋友们！今天咱来聊聊最小抑菌浓度实验，这可是个超有意思的事儿呢！首先呢，咱得准备好各种各样的家伙什儿。
就好比要去打仗，咱得把刀枪剑戟都准备齐全咯！那些培养皿啊、细菌混悬液啊、不同浓度的药液啊，一个都不能少。
然后呢，把培养皿摆得整整齐齐的，就像士兵排队一样。
再把细菌混悬液小心翼翼地倒进去，可别洒出来啦，那可就前功尽弃喽！这就好比给士兵们发武器，让它们准备好战斗。
接下来，就是重头戏啦！把那些不同浓度的药液依次加进去，就好像给细菌们设置不同难度的关卡。
低浓度的可能就是小打小闹，高浓度的那可就是大难关啦！这时候你可能会问啦，那怎么知道哪个浓度能抑菌呢？嘿嘿，这就需要我们耐心等待啦！等一段时间后，去观察那些培养皿，看看哪个里面的细菌没那么嚣张，乖乖地不怎么长啦，那这个浓度可能就是最小抑菌浓度咯！你想想看，这是不是就像一场和细菌的战斗游戏呀！我们是指挥官，指挥着药液去和细菌作战，看谁能赢。
有时候可能会有惊喜，有时候也可能会遇到挫折，但这就是实验的乐趣呀！在做这个实验的时候，可千万要仔细哦，不能马虎大意。
就像走钢丝一样，得一步一步稳稳当当的。
要是不小心弄错了一个步骤，那可能得到的结果就不准确啦，那不就白忙活啦！而且哦，这个实验还特别考验我们的耐心呢！不能着急，得慢慢来。
就像炖一锅好汤，得小火慢慢炖，才能出味道。
总之呢，最小抑菌浓度实验虽然有点麻烦，但真的很有趣也很有意义。
它能让我们更了解细菌，也能帮助我们找到更好的抗菌药物。
所以呀，大家可别小瞧了这个实验哦！让我们一起好好去探索这个神奇的细菌世界吧！。
抑菌实验
一、菌种(一)、细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；(二)、真菌：啤酒酵母（Saccgaromyces cerevisiae）、米曲霉（Aspergillusoryzae）3402、黑曲霉（Aspergillus niger）、叶点霉（Phyllosticta maydis ）和刺盘孢霉（Colletotrichum musae）二、培养基（一）细菌培养液：LB液体：胰蛋白胨10.0g酵母提取物 5.0gNaCl 10.0g10mol/LNaOH 100μL蒸馏水定溶至1.0LpH 7.0~7.4如要配置固体LB培养基，加15.0g琼脂糖/L(二)、真菌培养液：马铃薯培养基(PDA)马铃薯(去皮切块) 200.0g葡萄糖 20.0g琼脂 18.0g，蒸馏水 1000mLpH 自然三、器材培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管四、实验步骤(一)、抑菌圈的测定(滤纸片法)1、菌种接种将保存菌种反复转种2次，使菌种新鲜，细菌置30℃，温箱培养1d，霉菌置27℃，温箱培养3d，备抗菌实验用。
2、菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃，置旋涡混合器混匀。
3、倒平板在超净台里将培养基倒入平板，每板约15mL左右，水平放置，凝固后倒置放入30℃温箱中，2d后观察是否有菌落生长，若没有则可供下一步实验使用，否则需重新倒平板。
4、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板。
5、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。
每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。
抑菌试验方法
抑菌试验方法一、引言抑菌试验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对微生物生长的影响。
该试验可用于评估抗菌剂的效果、食品、药品和化妆品的微生物安全性，以及环境中抗菌材料的性能等。
本文将介绍抑菌试验的一般步骤和常用方法。
二、试验步骤1. 试验前准备在进行抑菌试验前，首先要准备好所需的试验材料和设备。
包括培养基、试验物质、细菌菌株、培养皿、试管、移液器等。
同时，要保持实验环境的清洁和无菌。
2. 菌种培养选择合适的细菌菌株，将其接种到含有适当培养基的试管中，并在37℃恒温培养箱中培养过夜，使其达到指定的细菌浓度。
3. 制备菌液将过夜培养的菌株转移到新的培养基中，通过菌液稀释法，制备出所需的菌液浓度。
菌液的浓度应根据试验要求进行调整。
4. 试验组装将试验物质分别添加到培养基或培养皿中，使其与菌液充分接触。
同时，设置对照组，用无抑菌物质的培养基或培养皿进行对照。
5. 培养条件将试验组和对照组置于适当的培养条件下，如温度、湿度等。
根据不同的试验要求，可选择不同的培养时间和培养条件。
6. 菌落计数在培养结束后，使用显微镜或肉眼观察试验组和对照组的菌落情况，并进行菌落计数。
菌落计数可通过平板计数法或滴定法进行。
7. 数据分析根据菌落计数结果，对试验组的抑菌效果进行评估。
常用的评估指标包括菌落形成率、抑菌率、最小抑菌浓度等。
三、常用方法1. 纸片扩散法该方法常用于评估固体试样的抑菌效果。
将试验物质涂布于纸片上，然后将纸片放置在含菌液的培养基表面上，通过观察菌落的生长情况来评估抑菌效果。
2. 悬浮液法该方法常用于评估液体试样的抑菌效果。
将试验物质与菌液混合，通过培养一定时间后，观察菌液的浑浊度或使用菌落计数法来评估抑菌效果。
3. 筛选法该方法常用于筛选具有抑菌活性的试验物质。
将试验物质与菌液混合后，通过培养一定时间后，观察菌落情况，筛选出对菌株有明显抑制作用的试验物质。
4. 斑点法该方法常用于评估试验物质对特定细菌菌株的抑菌效果。
抑菌圈实验步骤样品洗涤
抑菌圈实验步骤样品洗涤一、所用器皿及稀释液：1、检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。
2、用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。
如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。
3、检样的稀释液虽可用生理盐水或磷酸盐缓冲液，但以用磷酸缓冲盐水为合适，因为磷酸盐缓冲液对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。
如果对含盐量较高的食品(如，酱品等)进行稀释，则宜采用蒸馏水。
二、检样稀释：1、检样稀释时，应以无菌操作称取(或量取)有代表性的样品25g(或mL)剪碎放于含有225ml灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成l：10的稀释液。
如，系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀，或与稀释液同置于灭菌均质器杯或拍击式均质袋中，使做成均匀的1：10稀释液。
2、根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上述1:10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。
即取1：10稀释液1mL与9mL稀释液混和做成l：100的稀释液，然后依次递增稀释，做成1：1000、1：10000等稀释液。
注意每递增稀释一次，必须另换1支l mL灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数方为准确。
3、从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。
4、在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2、5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁时吸。
管内液体调至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。
初始污染菌计数方法适用性试验方案——供试品释出物的抑菌试验
初始污染菌计数方法适用性试验方案——供试品释出物的抑菌试验一、试验目的：评估初始污染菌计数方法在供试品释出物的抑菌试验中的适用性。
二、试验原理：初始污染菌计数方法是一种衡量样品中存在的细菌数量的方法。
该方法基于无菌培养基培养出来的菌落数量来评估污染程度。
在该试验中，我们将采用PCDA方法（Plate Count agar Dilution Assay）来测定细菌数量。
三、试验步骤：1.准备培养基：制备PCDA培养基，根据制备指南针对待测菌株适当调整培养基中的成分和浓度。
2.制备细菌悬液：采用细菌培养物或者菌落进行培养，转移到无菌的生理盐水中悬浮液中，均匀搅拌，稀释为一定的浓度。
3.固定试验板：使用已消毒无菌的平板，倒入适量的培养基，等待其凝固。
4.接种菌液：将待测供试品释出物样品取一定体积，在特定条件下和细菌悬液混合，根据需求数量在试验板上均匀涂抹或滴播。
同时设置对照组，不加入供试品释出物，只使用生理盐水或无菌培养基进行涂抹或滴播。
5.培养条件：将试验板置于一定的温度及湿度条件下培养一段时间，通常为24-48小时，根据实际需要在与菌株生长相关培养条件下进行培养。
6.统计菌落数量：根据实验结束后，试验板上形成的菌落数量进行统计，采用比较软件或者手计法进行计数。
7.数据分析：比较供试品释出物样品组和对照组的菌落数量，评估供试品释出物的抑菌效果。
8.重复试验：至少重复3次试验，以确保结果的准确性和可靠性。
四、风险评估与控制：1.使用无菌操作技术和器械，以防止试验过程中的细菌污染。
2.试验区域应保持清洁，避免其他细菌的污染。
3.注意操作培养基和细菌悬液的消耗期限和保存条件。
五、数据处理：比较供试品释出物样品组与对照组的菌落数量，使用适当的统计方法进行数据分析，评估供试品释出物的抑菌效果。
六、结果及讨论：通过对供试品释出物样品组与对照组的菌落数量进行比较，以及对多次试验结果的统计分析，评估初始污染菌计数方法在供试品释出物的抑菌试验中的适用性。
中草药对动物大肠杆菌体外抑菌试验步骤
中草药对动物大肠杆菌体外抑菌试验步骤选用27种不同的中草药制剂（煎剂、挥发油、蒸馏液），以平板稀释法和纸片法对同一株肉鸡源的大肠杆菌进行体外抑菌试验。
其试验结果表明，有14种中药对此株大肠杆菌有不同程度的抑制作用。
试验还表明中药制剂的配方工艺不同，其抑菌的效果亦有不同。
一、实验用材料方法1 材料（1）试验菌株肉鸡源大肠杆菌（安徽技术师范学院动物科学系预防兽医教研室提供）。
（2）培养基普通营养琼脂、麦康凯琼脂。
按常规方法制备。
（3）单味中药金银花、防风、板蓝根、白芷、连翘、杏仁、射干、辛夷、贯众、羌活、荆芥、藿香，中草药的煎制与蒸馏由安徽技术师范学院中药实验室完成，每毫升相当于1 g生药。
（4）复方中药银射煎液、麻杏射防煎液、羌藿连防煎液、辛芷荆煎液、辛芷荆蒸馏液、银射蒸馏液、羌藿连防蒸馏液、麻杏射防蒸馏液，每毫升相当于1 g生药。
2。
方法（1）大肠杆菌对中药（单味、复方）敏感性的体外试验-平板稀释法。
取1 ml原药液为第1支试管；在第2支试管中分别加入0.5 ml原药液和0.5 ml生理盐水以倍比稀释法稀释至第4支试管；第5支试管为无药对照管。
先分别把药液倒入无菌的平皿中，后倾入60℃无菌普通营养琼脂或麦康凯琼脂，并迅速混合均匀，制成平板。
以无菌的涂抪棒蘸取试验用细菌均匀涂抪于平板表面，置37℃培养箱内培养24 h，后观察结果。
（2）在第1支试管加入8 ml原药液，第2支试管加入4 ml原药液，第3支试管加入2 ml原药液，第4支试管加入1 ml原药液，第5支试管为无药对照管，在第2支试管至第5支试管中分别加入4 ml、6 ml、7 ml及8 ml生理盐水；按照1 2 1 1项方法制成平板，涂抪细菌后置37 ℃的培养箱中培养24 h后，观察并记录结果。
（3）大肠杆菌对中药（单味、复方）的敏感性试验——纸片法将筛选出的对大肠杆菌有明显抑制作用的复方、单味中药制剂分别制成药敏纸片，测定抑菌圈的大小。
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1.培养基的制作（PDA培养基）：
制作：新鲜土豆200g（去皮后），切成小块（差不多宫保鸡丁的小块那么大），加入蒸馏水约1000mL（可以适当多加点，因为煮的过程中水分要蒸发），水煮沸时开始计时，30min 后，停止加热，用纱布过滤（3层），补充滤液至1000mL，滤液中加入2%的葡萄糖（即是20g），滤液加热后，加入1.5%琼脂（15g），即制作好了培养基
分装：趁热将制作好的培养基用20mL移液管移至玻璃管中，每管19mL。
灭菌：将装好的培养基，包扎，灭菌。
（121℃20min）需要灭菌的物品还有：移液枪枪头；玻璃棒（直径小于5mm的）；内直径5mm的塑料小管
2.药液的配制：
万分之一天平称取待测物质0.02g于10mL离心管中，加入二甲桠枫将其溶解（尽量少用溶剂，一般200uL加入后即可，如果不能溶解，再加。
一般加入溶剂后稍微加热即可溶解）；再加入配制好的千分之一的吐温804.8mL（使溶液体积为5mL），即配制好了100ppm（此时的浓度并非100ppm，而是后面加入培养基后的浓度）的药液，梯度稀释成50ppm、25ppm、12.5ppm、6.25ppm。
空白的也要加入二甲桠枫和吐温80.
50ppm（都是最后在培养基中的浓度）硫酸链霉素的配制：精确称取硫酸链霉素0.05g 于25mL比色管中，蒸馏水定容。
（加入该物质是为了抑制细菌生长的）
3.倒平板：培养基灭菌完成后趁热拿到超菌台，分别加入0.5mL的药液和0.5mL的硫酸链
霉素溶液（此操作最好两人分别完成），然后，一人将培养基摇匀，另一人将摇匀的培养基倒入事先已灭菌烘干的平板中（在酒精灯旁完成）。
两人合作实验时，分别坐在超菌台的两边。
4.接种：待培养基凝固后，一人A用直径5mm的塑料管戳取菌种菌饼，另一人B左手拿
培养皿，打开盖子，A将有菌饼的小管移至培养皿中心，B右手用灭菌的玻璃棒将其戳出，粘于培养皿中心，即可。
（此操作在酒精灯旁进行）
5.培养：25℃培养玉米小斑病菌、水稻立枯丝病菌、小麦赤霉菌、灰葡萄孢；28℃培
养油菜菌核菌。