微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
微生物分离鉴定步骤
微生物分离鉴定步骤
微生物的分离和鉴定是微生物学研究中非常重要的步骤，它可
以帮助我们了解微生物的种类和特性。
通常，微生物的分离和鉴定
包括以下步骤：
1. 样品收集，首先需要收集来自环境、生物体表面或其他来源
的微生物样品。
这可能涉及到采集土壤、水样、食品、空气或生物
体组织等样品。
2. 稀释和接种，将样品进行适当的稀释，然后在培养基上进行
接种。
这有助于分离出单一的微生物菌落，以便进行后续的鉴定。
3. 培养，接种后，将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。
不同
类型的微生物可能需要不同类型的培养条件，如温度、氧气含量等。
4. 分离，在培养一段时间后，可以观察到菌落的形成。
选择单
一的菌落，进行分离培养，以获得纯培养物。
5. 形态学特征观察，观察微生物的形态学特征，包括细胞形态、大小、颜色等，可以初步了解微生物的特征。
6. 生理生化特性测试，进行一系列生理生化特性测试，如对不同营养物质的利用、酶活性、氧气需求等，以进一步了解微生物的特性。
7. 分子生物学鉴定，利用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，可以对微生物进行更精确的鉴定，包括确定其属种和种的分类位置。
以上是常规的微生物分离和鉴定步骤，通过这些步骤可以全面地了解微生物的特征和分类位置。
值得注意的是，不同的微生物可能需要不同的鉴定方法，有时可能需要结合多种手段进行鉴定，以确保鉴定结果的准确性。
细菌接种实验步骤
细菌接种实验步骤实验目的：细菌接种实验是为了观察细菌在不同条件下的生长情况，进而了解细菌的生物学特性和对不同因素的响应。
实验材料：1. 培养基：含有必需营养物质的培养基，如琼脂、葡萄糖、氯化钠等。
2. 细菌菌种：选择已知种类的细菌菌株，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
3. 培养皿：用于培养细菌的平底培养皿。
实验步骤：1. 准备工作：将培养基加热至溶解，然后冷却至适宜温度（通常为50-60℃），并倒入培养皿中。
待培养基凝固后，进行下一步操作。
2. 细菌接种：取一支已经保存良好的细菌菌株，用无菌的铁环沾取菌液，然后将铁环轻轻划过培养基表面，使菌液均匀分布在培养基上。
3. 培养条件：将接种好的培养皿盖好，放置在适宜的温度下（通常为37℃），并避免阳光直射。
不同种类的细菌对温度要求不同，因此需根据菌株的特性进行调整。
4. 培养时间：根据所要观察的现象和实验目的，确定培养时间。
通常细菌接种后的第一天是菌落形成的初始阶段，第二天开始菌落逐渐扩大，第三天开始菌落逐渐稳定。
5. 观察记录：在培养过程中，要定期观察和记录细菌的生长情况。
可以记录菌落的形状、颜色、大小等特征，并观察是否有溶解现象或其他异常情况。
6. 结果分析：根据观察记录，进行结果分析。
可以比较不同条件下细菌生长情况的差异，进一步探究影响细菌生长的因素。
注意事项：1. 实验过程要注意无菌操作，避免外界细菌的污染。
2. 实验室环境应保持清洁，避免灰尘等杂质进入培养皿。
3. 实验结束后，要妥善处理培养皿和细菌菌株，避免对环境和人体造成危害。
实验结果：通过细菌接种实验，我们可以观察到不同细菌菌株在不同条件下的生长情况。
例如，我们可以发现某些细菌在高温下生长迅速，而在低温下生长缓慢；或者某些细菌对特定营养物质有较强的需求，只有在提供了这些营养物质的情况下才能正常生长。
这些结果为我们进一步研究细菌的生态、抗菌剂的开发等提供了基础。
细菌接种实验是微生物学中常见的实验方法，通过此实验可以更好地了解细菌的生长特性和生态习性，为疾病的预防和治疗提供理论依据。
《微生物学实验》操作步骤
实验一培养基的制备与灭菌实验步骤：（一）伊红美蓝培养基（EMB，用成品，分离大肠杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。
按成品说明称量、放入搪瓷杯，加水，加热完全溶化，倒入三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，作标记（培养基名称、批次组别、日期，下同），灭菌。
（二）营养琼脂培养基（即牛肉膏蛋白胨培养基，用成品，分离芽孢杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基，方法同上，灭菌。
（三）PDA培养基（即马铃薯蔗糖培养基，分离酵母菌、根霉用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。
培养基配方：马铃薯20%、蔗糖（白砂糖）2%、琼脂 2%，加水至所需体积，pH自然。
配制方法：马铃薯去皮，称量，切成小方块，放入搪瓷杯，加水适量，煮沸20 min，取汁液，补水至所需体积，加入蔗糖（白砂糖），加热溶化，最后加入琼脂（琼脂要预先单独用水浸泡，然后挤干再加入），加热至琼脂完全溶化，分装三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，灭菌。
培养基统一高压蒸汽灭菌（121℃25 min）。
（四）无菌平皿准备（下次实验倒平板用）每组10套，报纸包扎，高压蒸汽灭菌（121℃25 min）后，置干燥箱80℃烘干1 h。
（五）枯草样预处理及预培养（下次实验分离芽孢杆菌用）枯草样预处理：每组1瓶。
100 ml三角瓶＋自来水约50 ml，加5%可溶性淀粉，溶解。
枯草若干，剪短，浸入三角瓶水中，牛皮纸封口，包扎，置水浴中煮沸10 min，然后置培养箱30℃预培养3～7 d。
（六）葡萄样（或其它水果）酵母菌预培养（下次实验分离酵母菌用）每组1瓶。
葡萄（或其它水果）适量，捏碎，皮渣与汁液一起放入250 ml 三角瓶（装量1/2～2/3），封口，置培养箱25℃预培养3～7 d，观察自然发酵过程。
实验二微生物的分离与纯化实验步骤：（一）污水中大肠杆菌的分离（稀释倒平板法）1）用三角瓶取污水样适量。
分离接种实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握微生物分离接种的基本原理和方法；2. 熟悉微生物纯种培养技术；3. 提高无菌操作技能。
二、实验原理微生物分离接种是微生物学实验中的一项基本操作，其主要目的是从混杂的微生物群体中分离出所需的纯种微生物。
实验原理主要包括以下两个方面：1. 稀释分离法：通过将微生物群体在适宜的培养基上进行稀释，使每个稀释度内仅含有一个或几个微生物细胞，然后选取单菌落进行培养，从而达到分离纯化的目的。
2. 选择培养法：根据微生物对特定条件的适应性，选择合适的培养基和培养条件，使所需的微生物生长繁殖，而抑制其他微生物的生长，从而实现分离纯化。
三、实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等；2. 培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基、琼脂糖固体培养基、液体培养基等；3. 试剂：无菌水、无菌生理盐水、无菌酒精、无菌接种环等；4. 仪器：无菌操作台、酒精灯、接种环、接种针、显微镜等。
四、实验步骤1. 准备工作（1）将无菌操作台、酒精灯、接种环、接种针等实验器材进行消毒处理；（2）将牛肉膏蛋白胨固体培养基和琼脂糖固体培养基在无菌条件下进行配制，并倒入培养皿中，待凝固后备用；（3）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等菌种在无菌条件下进行复苏，并制备成菌悬液。
2. 微生物分离接种（1）稀释分离法① 取无菌接种环，蘸取菌悬液，在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上进行划线；② 重复上述操作，使菌悬液在平板上形成一系列平行线；③ 将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；④ 观察菌落生长情况，选取单菌落进行纯化培养。
（2）选择培养法① 将菌悬液接种于琼脂糖固体培养基平板上；②在平板上加入适量抗生素，使平板成为选择培养基；③ 将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；④ 观察菌落生长情况，选取单菌落进行纯化培养。
3. 纯化培养（1）将单菌落挑取至新的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上；（2）将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；（3）观察菌落生长情况，确认纯化成功。
微生物培养的一般流程
微生物培养的一般流程
1. 样品消毒：在培养实验之前用70%的酒精和其他消毒剂对样品的表面进行消毒。
2. 配制培养基：根据不同的培养条件，依据需要选择和添加适当的营养物质，经过称重调配后，组成所需的培养基，再配制到培养管或者培养皿中。
3. 样品制备：将消毒后的样品细分，利用均质器进行均质，确保培养基中所有单位都被微生物接触到。
4. 样品接种：在上述步骤完成后，将样品放入培养容器中。
5. 培养：根据实验要求，设置温度和湿度，调整光照，安排搅拌，移液等，创造合适的细菌生长条件。
6. 分离：当培养基中出现视觉上显著的菌落时，利用接种法或分离链植物就可以得到纯培养的微生物。
7. 鉴定：对分离出的纯培养微生物进行鉴定和分类，确定其种类。
微生物的接种分离和纯培养
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出； 2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法
计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由 于两者之间存在着距离使之形成一定容积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小 室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成 单位体积的样品中所含的菌数。
度。
思考题
1. 微生物的纯种分离通常采用那些方法，并说明个 方法的特点。
2. 什么叫微生物的污染？如何防止？ 3. 从两种方法计数得出的菌液浓度是否一致？分析
误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺点及 各自的适用范围。 4. 平板活菌计数中，为何选择生长有25～250个菌 落的平板？
碰到火焰，以免烧死菌体 6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡 7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
实验安排（三人一组）
斜面接种：每组三支 液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支） 穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支） 平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液) 稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液) 血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术是微生物学实验室中最基本、最重要的实验技术之一。
其主要原理是将混合微生物群落分离为单一的微生物菌落，并在适宜的环境条件下使其生长繁殖形成单一菌种培养物，以便进行鉴定和研究。
1.微生物的分离技术
（1）稀释涂布法：将微生物混合液逐渐稀释，然后取一定量的稀释液涂布在富养基平板上，待菌落形成后，挑取单一菌落进行培养和研究。
（2）过滤法：利用微孔膜或滤纸将混合液过滤，将过滤后留在微孔膜或滤纸上的微生物进行培养和研究。
（1）液体培养：将微生物接种在富足的液体富养基中，置于适当的温度、光照和通气条件下进行培养。
（3）混合培养：将两种或以上的微生物同时接种在同一富养基上进行培养，这一技术可同时培养多种微生物，缩短实验时间。
3.技术应用
微生物的分离与培养技术在微生物学研究、医学诊断、生物工程和食品工业等领域都得到广泛应用。
（1）微生物学研究：分离单一菌种进行研究，为微生物学研究提供基础。
（2）医学诊断：从临床样品中分离出致病微生物进行培养与鉴定，有助于快速准确地诊断、鉴定和治疗病原微生物感染。
（3）生物工程：在微生物培养基中添加营养物质，用微生物进行合成、代谢和分泌等反应。
（4）食品工业：将微生物培养在富有营养的富养基中进行发酵，生产出发酵食品。
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微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤
一、目的要求
1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明
微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料
1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤
（一）接种的操作
1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）
（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
（9）将接种环烧红灭菌。
放下接种环，再将棉花塞旋紧。
2、液体接种
（1）由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。
接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。
（2）由液体培养基接种液体培养基，菌种是液体时，接处除用接种环外尚用无菌吸管或滴管。
接
种时只需在火焰旁拔出棉塞,将管口通过火焰,用无菌吸管吸取菌液注入培养液内,摇匀即可。
3、平板接种
将菌在平板上划线和涂布。
（1）划线接种见分离划线法。
（2）涂布接种用无菌吸管吸取菌液注入平板后，用灭菌的玻棒在平板表面作均匀涂布。
4、穿刺接种
把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能用。
（1）操作方法与上述相同，但所用的接种针应挺直。
（2）将接种针自培养基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途径慢慢拔出。
（二）分离的操作方法
1、稀释分离法
通过不断稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板与温度适合溶化了的琼脂培养基混合，这样分散的细菌被固定在原处而形成单菌落。
（1）将大肠杆菌或酵母菌用无菌水制作菌悬液。
（2）取若干支无菌试管，每支内盛9ml无菌水。
（3）吸取1ml制备好的菌悬液，置于第一支含有9ml无菌水的试管内，这样就稀释了10倍，也就是10-2。
（4）从第一支试管内（10-2）吸取1ml注入第二支含有无菌水的试管内，这样就稀释了100倍，也就是10-2。
（5）用同样方法操作，直至稀释至10-5-10-6。
（6）分别精确吸取10-5-10-6各稀释度菌液0.2ml加入编好号的空无菌平皿中，同一稀释度重复做三个平皿。
（7）将已溶化并冷却至45℃的琼脂培养基倒入上述各平皿内，轻轻旋转使培养基与菌悬液充分混匀，凝固后倒置于37℃或38℃度恒温箱中培养24-48小时，观察平板上菌落生长和分布情况。
2、平板划线分离法
平板划线分离法是接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种方法。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的。
（1）倒平板溶化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板，水平静置待凝。
（2）在酒精灯光焰上灼烧接种环，待冷，取一接种环金黄葡萄球菌、大肠杆菌混合菌液。
（3）左手握琼脂平板稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种环伸入皿内，在平板上一个区域作之形回划线，划线时例接种环与平板表面成30-40°角度轻轻接触，以腕力在表面作轻快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进增基内。
（4）灼烧接种杯，以杀灭接种环上尚残余的菌液，待冷却后，再将接种环伸入皿内，在第一区域划过线的地方稍接触一下后，转动90°，在第二区域继续划线。
（5）划毕后再灼烧接种杯，冷却后用同样方法在其他区域划线。
（6）全部划线完毕后，在平皿底用特种蜡笔注明菌种、日期、组别、姓名。
将整个培养皿倒置放入恒温箱培养。
（7）37℃经过24-48小时培养后取出观察。
注意菌落的开关、大小、颜色、边缘、表面结构、透明度等性状。
附一无菌操作环节
（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。
每次使用前，均应用紫外灯灭菌。
定期对接种室作无菌程度的检查。
（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。
工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。
不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。
（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。
移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。
（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。
（5）培养箱应经常清洁消毒。