Rt-PCR 实验方法
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验步骤一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20℃ 冰箱冻存三、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
RT-PCR实验方法总结1,2RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RT-PCR 步骤
三2、PCR反应体系：约5小时
25mM MgCl2
3μl
10×PCR 缓冲液
5μl
10mM dNTP
1μl
上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2
CDNA模板
5μl
ddH2O
30μl
Taq酶
1μl
轻质石蜡油
50μl
100μl
1. 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第
一个步1个循环
注： 1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解 2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年 以上） 3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年
两步法RT-PCR （第一步：逆转录反应） 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23μl(11.5μl) Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl （稀释10倍后用）
一、组织抽提： 1. 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末 2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆 3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打 4. 冰上孵育5分钟 5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移
入1.5ml新离心管 6. 加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟 7. 离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移
↓ 加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟 ↓ 4℃，离心12000g，10分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml ↓ 4℃离心7500g，5分钟 ↓ 弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥） ↓ 溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl） （可在55-60℃水中，<10分钟助溶）
RT-PCR实验
1.PCR反应基本步骤
（1）变性：高温使双链 DNA解离形成单链 （94℃，30s） （2）退火：低温下，引 物与模板DNA互补区结 合（55-60℃，30s） （3）延伸：中温延伸。 DNA聚合酶催化以引物 为起始点的DNA链延伸 反应（72℃，60s)
2.PCR体系
上游引物 下游引物 模板cDNA dNTP Taq酶(final) 0.5ul 0.5ul 0.5ul 1ul 0.5ul
(2)电泳跑胶：琼脂糖溶液凝固后，拔出梳子， 放入到电泳槽中（电泳槽中有缓冲液），取 5ul的RNA样品加入1ul的loading buffer，用 枪头吹打混匀，然后加入到凝胶上做好的加 样孔中。将电泳槽连接到电泳仪的正负极， 启动开始电泳。（ RNA电泳的电压200v，10 分钟左右，方向负极到正极）
RT-PCR实验总结
RT-PCR是从RNA中扩增目的DNA的技术，其步 骤是将RNA逆转录成cDNA，再以此cDNA为模板进行 PCR。
一.组织RNA提取 二.逆转录（RT） 三.PCR
1.操作步骤： （1）将100mg左右组织放入研钵中，加液氮将组织 研磨成粉末状，然后加1ml的Trizol（有毒，切勿 沾到皮肤上），继续加液氮，研磨成粉末状，然 后将粉末导入到离心管中，冰上5min。 （2）往离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀， 冰上5min。 （3）4℃，12000g离心 15min（冰冻离心机），取 上清液移入新的离心管中（切勿吸入离心管下层 的沉淀），然后往新管中加入等体积的异丙醇， 轻微混匀，冰上10min。
（3）评价RNA提取纯度的方法 跑胶结束后，在紫外透射分析仪中观察到三条 条带，最靠近加样孔的是28s,然后依次是18s,5s 的条带。 是否降解 a b 纯度 a b c 条带宽窄 有无拖尾现象 加样孔有无条带 28s：18s ≧2 5s条带不太亮
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
RT-PCR的步骤
RT-PCR的步骤引言逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，用于从RNA样本中扩增特定的DNA片段。
该技术可以检测和定量特定基因的表达水平，并在疾病诊断、药物研究等领域发挥重要作用。
本文将介绍RT-PCR的步骤及其基本原理。
步骤1. 提取RNA在进行RT-PCR之前，首先需要从细胞或组织中提取RNA。
常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、硅胶酸盐柱法等。
通过这些方法，可以将总RNA或特定种类的RNA从样本中纯化出来，为后续的实验步骤提供RNA样本。
2. 逆转录（RT）逆转录是将RNA转录为相应的cDNA（互补DNA）的过程。
逆转录反应中使用逆转录酶，该酶具有转录RNA为cDNA的能力。
在逆转录反应中，逆转录酶合成一个与RNA模板互补的cDNA链。
常见的逆转录酶包括M-MLV逆转录酶和SuperScript逆转录酶等。
3. PCR扩增PCR扩增是通过引物（寡核苷酸序列）将需要扩增的目标DNA片段进行反复循环扩增的过程。
在PCR反应中，每轮反应包括三个步骤：解链、引物结合和延伸。
通过不断循环这三个步骤，DNA片段将被指数级扩增。
4. 凝胶电泳PCR扩增后，我们需要将扩增产物进行凝胶电泳，以确认是否扩增成功，并确定目标DNA片段的大小。
在凝胶电泳中，将PCR产物加载到琼脂糖凝胶孔中，并施加电场，1使DNA片段在凝胶中迁移。
通过与已知大小的DNA分子量标准进行比较，可以确定PCR扩增产物的大小。
结论RT-PCR技术已经成为分子生物学领域中不可或缺的工具。
通过逆转录和PCR扩增，可以快速、准确地扩增RNA样本中感兴趣的DNA片段，为疾病诊断和基因表达研究提供了重要的技术支持。
了解RT-PCR的步骤和基本原理，有助于更好地应用该技术进行实验和数据解读。
2。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。
实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。
通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。
材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。
2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。
3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。
4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。
结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。
实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。
例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。
这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。
这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。
进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。
结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。
实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。
这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。
RT-PCR实验方案
●1st-Strand cDNA 合成反应 1.在 Microtube 中配制下列混合液. 试剂 Oligo dT Primer(50 μM) dNTP Mixture(10 mM each) 模板 RNA RNase Free dH2O 2.65℃保温5 min后,冰上迅速冷却. (注:上述处理可使模板RNA变性,提高反转录效率. ) 3.离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部. 4.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液,总量为20 μl. 试剂 上述变性后反应液 5×PrimeScript II Buffer RNase Inhibitor (40 U/μl) PrimeScript II RTase (200 U/μl) 用 RNase H 型反转录酶是不是好点?-使用量 1 μl 1 μl Total RNA:5 μg 以下 (我们取的 是 3-4ug) Up to 10 μl使用量 10 μl 4 μl 0.5 μl(20 U) 1 μl(200 U) Up to 20 μlRNase Free dH2O 5.缓慢混匀.6.按下列条件进行反转录反应: 50℃ 60 min (因为离心机温度会有稍微的下降和上扬,我们决定以后选取47°,然后 时间第一次做是反应了60min) 注:PrimeScript II RTase对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能,通常可在 42℃下进行反应.使用特异性下游引物进行反转录时,有时会因错配而产生非特异性扩增. 此时可将反转录温度升到45～50℃,可能会减少非特异性扩增. 7.95℃ 5 min(酶失活)后,冰上冷却.测OD值及浓度. 注:进行长片段cDNA扩增时,为了避免1st cDNA链的破损,需进行70℃,15 min的失活 反应.(这一步我们没有做,因为我们觉得不是长片段) 如需保存,保存于-20°冰箱.●RT-PCR反应 1. RT时,先打开PCR预热30分钟. (另外,进行PCR反应,模板DNA应高度纯化,不含任何 蛋白质,RNA和单核苷酸.这些杂质的存在会降低Mg离子的有效浓度. ) 2. 基因组DNA,模板DNA的浓度调节到0.1~1ug/ul,而质粒或噬菌体模板DNA调节到 0.01~0.1ug/ul.用10ul的PCR体系,模板cDNA可以取少一些.取1ul cDNA产物到新PCR 管中,稀释5倍,然后取1ul做模板即可,余下的-20°保存. 3. 引物浓度调节到0.1~1umol/L.每OD的引物加 49 ul 的缓冲液配成100 uM的贮存液. 4. 在PCR反应管中加入25ul的2*PCR Master, 1ul的DNA模板, 引物各取1ul, 去离子水加23ul, 全量50ul; 所用试剂盒为生工即用PCR扩增试剂盒,试剂盒组成:Components2*PCR Master Sterial ddH2O 25mmol/L MgCl2 ManualSK2071 0.5ml 1ml 0.5ml 1SK2071 5* 0.5 ml 5* 1 ml 1 ml 1注:2*PCR Master含有3mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,0.1U/ul Taq DNA聚合酶和2*PCR 缓冲液. 加样如下: 试剂名称 上述cDNA溶液 Forward Primer (10 μΜ) Reverse Primer (10 μΜ) 2*PCR Master dH2O 使 用 量 1 μl 0.2 μl 0.2 μl 5 μl up to 10 μl5. 混匀后用掌上离心机甩一下,然后沿PCR管壁缓慢加入15ul左右的矿物油封闭. 6. PCR反应条件如下: 94° 5 min 94° 30 sec 55° 30 sec 72° 3 min 72° 10min35 Cycles7.RT-PCR扩增结果 PCR反应结束后,取5ul PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳. (M: 200 bp DNA Ladder)引物均使用第一个,AGH,GIH,actin 10ul体系,0.8ul模板cDNA,1ul 上下游引物,PCR master 5ul,H2O 2.2ul 退火温度:55 眼神时间:1min。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Rt-PCR实验步骤
一、实验器具与材料：
1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头：1ml、200μl、20μl
3、匀浆管：5ml
4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）
1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、试管架：5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水
11、铝制饭盒：4个
12、塑料小饭盒：1个
13、大瓷缸：2个
14、锡泊纸：一卷
15、卷纸：2卷
16、三角烧瓶：带盖，稍大
二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）
3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）
三、试剂配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC 水需先高压）
3、异丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制：
1、电泳缓冲液：
Tris 54g
硼酸27.5g
0.5M EDTA 20ml？pH8.0
蒸溜水1000ml
5×TBE （贮存液）
再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液：
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×缓冲液，4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制：
1、1.0%：
1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭
2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%:
同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的Rt-PCR材料：
（生工. Tel. 2236106.）
Taq酶（含MgCl2Buffer）200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支110
——-20℃DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶Invitrogen Life technologies
——4℃Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成
1、内参照：
GAPDH
正义：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′
反义：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′
β-actin
正义：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′
反义：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′
2、par-4:
正义：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′
反义：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′
3、退火温度计算
2（A+T）+4（G+C）
正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好
5、引物稀释：
加DEPC水量为（μl）
= ? nmol / OD ×管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
九、几个注意点：
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？
2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前，打开离心机预冷。
组织100mg ↓
加1mlTRIzol
↓ 匀浆（要彻底，后转至EP 管） （组织匀浆量>100mg 时分装1ml/每EP 管） ↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积（0.2ml ）（必须按总体积的1/5）
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
4℃，离心12000g ，15分钟
↓
转上层水相（约400μl ）于另一1.5mlEP 管中
↓
加等体积异丙醇（约400μl ），混匀室温10分钟
↓
4℃，离心12000g ，10分钟
↓ 弃上清 ↓
加冰预冷的75%乙醇（用DEPC 水配）1ml
↓
4℃离心7500g ，5分钟
↓
弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC 水中至20μl （10μl-20μl ） （可在55-60℃水中，<10分钟助溶）
注：
1、RNA 若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC 溶解
2、细胞组织加TRIzol 匀浆后，可在-60
℃放置至少一个月（甚至可一年以上） 3、RNA 在75%乙醇中，2-8
℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年
（第一步：逆转录反应）
（稀释10倍后用）
↓
混匀，离心，70℃5min
↓
立即冰水浴，稍离心
↓
总体积40μl（20μl）
↓
混匀，离心，42℃60min
↓
95℃10min（破坏MLV）
↓
4℃保存
（第二步：PCR反应）
总体积20μl(50μl)
↓
混匀
↓
97℃，5分钟
↓
立即冰水浴
↓
混匀
↓
三、电泳：
加1-10μl PCR产物+溴芬兰（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。
注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。
DNTP勿反复冻融。