RT-PCR实验方法总结大全.
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
RT-PCR实验方法大全(抽提RNA,RT,PCR)-3
RT-PCR实验方法大全(抽提RNA，RT，PCR)-34. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RN A酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Pol y(A)尾巴。
绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的 Poly （A）尾，通常用Poly（A+）表示。
这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。
此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。
实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。
通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。
材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。
2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。
3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。
4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。
结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。
实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。
例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。
这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。
这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。
进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。
结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。
实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。
这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。
rt pcr实验报告
rt pcr实验报告RT-PCR实验报告引言：RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和定量RNA的表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR方法分析目标基因在不同组织和条件下的表达情况，从而深入了解其功能和调控机制。
材料与方法：1. 细胞或组织样本：选择不同类型的细胞或组织样本，如肝脏、肺、肌肉等。
2. RNA提取试剂盒：使用RNA提取试剂盒提取样本中的总RNA。
3. 逆转录试剂盒：使用逆转录试剂盒将RNA转录为cDNA。
4. PCR试剂盒：使用PCR试剂盒进行聚合酶链式反应。
5. 热循环仪：使用热循环仪进行PCR反应。
实验步骤：1. 样本处理：将细胞或组织样本收集并保存在合适的条件下，以保持RNA的完整性。
2. RNA提取：按照RNA提取试剂盒的说明书进行操作，提取样本中的总RNA。
3. RNA浓度和纯度检测：使用紫外-可见光分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保提取到高质量的RNA。
4. 逆转录反应：按照逆转录试剂盒的说明书进行操作，将RNA转录为cDNA。
5. PCR反应：按照PCR试剂盒的说明书进行操作，设置合适的引物和反应条件，进行PCR反应。
6. 凝胶电泳：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
7. 凝胶图像分析：使用凝胶图像分析软件测量PCR产物的带的强度，并进行定量分析。
结果与讨论：通过RT-PCR实验，我们成功地分析了目标基因在不同组织和条件下的表达情况。
以下是实验结果的一些典型示例：1. 基因在不同组织中的表达差异：我们选择了肝脏、肺和肌肉作为研究对象，分别提取了这些组织中的总RNA，并进行了RT-PCR分析。
结果显示，目标基因在肝脏中的表达水平最高，肺次之，肌肉最低。
这表明目标基因在不同组织中的表达存在差异，可能与其功能和组织特异性有关。
2. 基因在不同条件下的表达调控：我们进一步研究了目标基因在不同条件下的表达调控。
RT-PCR的操作方法(终极版)
qRT-PCR实验步骤一、试剂准备1. 自备试剂：75%乙醇（以去RNAase H₂O配置）、氯仿、异丙醇、无RNAase H₂O。
2. 相关试剂盒（给出货号）等。
3. 无菌的epp管、PCR管、tip头等耗材。
二、注意事项1. 全称佩戴手套、口罩，穿白大褂。
女生需将长发扎起。
2. 自2.3至3.1步骤，必须使用无RNAase耗材（包括枪头和epp管）。
3. 所有试剂专用，不得与其他实验混用。
三、实验步骤1. 样品准备1.1. 动物组织：取新鲜或-70°C冻存组织，每30-50 mg 组织在液氮中充分研磨，也可以加入1 ml TotalRNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。
样品体积一般不要超过TotalRNAExtractor 体积的10%。
1.2 单层培养细胞的收集：可直接在培养容器中裂解（培养面积不超过10 cm2，细胞不超过1×107），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。
a. 直接裂解法：吸弃培养液，PBS清洗一次。
直接在培养板中加入TotalRNAExtractor 裂解细胞，每10 cm2面积加1-2ml TotalRNAExtractor（6孔板一般使用500-1000ul)。
用移液器吹打混匀。
TotalRNAExtractor 加量根据培养板面积决定，而不是由细胞数决定，如果加入的量不够，将导致提取的RNA 中有基因组DNA 污染。
b. 胰蛋白酶处理法：收集细胞并大致确定细胞数量，用PBS 洗涤细胞后，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至无RNase 的离心管中，5000 rpm 离心 5 min，收集细胞沉淀，去除上清，PBS重悬，清洗一次，离心去上清。
每10 cm2面积加1 ml TotalRNA Extractor。
用移液器吹打混匀。
收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA 得率。
RT-PCR实验方法简介-PCR
RT-PCR实验方法简介RT-PCR定义：是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。
RT-PCR流程简介一、抽提RNA：1、防止RNA酶污染180℃的高温下干烤6hr以上；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；去污剂洗涤，双蒸水冲洗；溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用；操作人员戴手套；器械专用。
2、材料的准备组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下；尽量避免材料的冻融。
3、确认RNA的质量检测RNA溶液的吸光度：OD260/OD280=1.8－2.0RNA的电泳图谱：28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。
二、反转录：单管一步法:反转录和PCR反应在一个管子中完成，得到的全部cDNA产物都一起经PCR 扩增，灵敏度更高，但是容易相互干扰。
两步法:反转录和P CR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。
三、PCR：1、参照基因PCR参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量的基因），常用18S、β－actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍；参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下，称之为内参；参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参；由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或造成其它干扰，外参的应用较为普遍。
2、目的基因PCR典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
RT-PCR实例：1、实验材料：拟南芥野生型Ws及突变体m1、m2花序2、实验目的：分析m1、m2与野生型花序中G1基因的表达的差异3、实验步骤：设计ACTIN及G1基因的引物；分别抽取野生型Ws及突变体m 1、m2花序RNA，DNase I处理，以尽量去除基因组DNA；电泳检测，估计R NA总量；取1ug左右的RNA进行反转录；取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－2 5个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR；取等量产物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如m1的亮度为Ws的2倍，则下次PCR时m1的模板为0.5ul），直到电泳亮度基本一致，可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。
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RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。
要求:1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng 或1ug。
2. RT按要求做,一般不会出太大问题。
3. PCR,按常规。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA 存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。
如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上,还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?问题:在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教!解答:1.RT-PCR有两种做法:条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。
(promega。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE;引物的(最好产物短点;若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样;体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico,但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法,而另一个基因的3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。
有关内参:RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些,最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。
问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。
虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍。
请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度?答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount justusing "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量的^-^,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。
Mg就跟不能变了,一变整个体系就变了。
能看到均一条带就很好了。
关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑虽然用不着,但是摸上3、5摸总是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。
有关内参的建议:一定要做内参的,每一次,我想。
不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都谈了,再说一边我得观点,1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非你能准确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。
2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的,3、半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,GC含量相似,或者实在穷的要省PCR管和taq。
关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。
看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶促动力学的问题,这个我也不懂,有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的东西。
我们学医的,也没必要知道那些,但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的,酶一直是过量,再加酶也没用,引物ntp都是这样。
烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是要在你的凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种的契合点。
给你一张图你就明白了,再开始的时候酸的是切线,这图我在 *** 帖过。
关于引物设计,再可能的情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不过,根据要求,还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组PCR、长度小于500bp-600bp等等。
引物当然要设计成一样的退火温度,即使不再一管中,也要一样的,要在一台机器里啊。
我的引物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来披,也不用查。
我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件的时候,还没发现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问题呢?18s的引物也和著名的βactin一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是限制是只能用总RNA为模板,但是比actin和bubulin等可准多了,更不要说GAPDH 这个破烂了。
18s除了在细胞中更相同(量外,主要是它占的比例远远高于看家基因,所以定量更加准确,我想,不知对不对,请几位主任和eeflying指教。
我认为,就像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的东西,说一座房子是由2000块砖造成的,比说又29根梁更准确吧。
更不要说没有看家基因不看家的缺点,因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒,就是用18s,不过我们看懂使用的那条序列,不知有没有人用过,告知其序列和genbank号。
正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完,当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列?原位杂交最好用RNA做探针,效果好一些,反正你有钱卖roche的盒子,而且量也能保证,因为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了。
正义反义也容易理清。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难,有时就是得不出结果。
因此,我认为因为每个人所要克隆的片断不同,引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明:做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的RT-PCR时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下游引物进行逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。
后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断(尽管她用这些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物,因此,我先用她的引物和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9mers随机引物,用我的引进物进行一般PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确。
尽管我的这个经历别人很人遇到,但足可以说明实验可以有自己的模式,书本的知识和别人的经验很重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问:1 引物的特异退火温度怎样设定?可以根据gc 和at含量算出吗?可以用引物报告单上的Tm值吗?2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适?MgCl2应加多少?各个成分的量有无确定标准?3 PCR结果跑电泳,actin有,但跑不出目的条带,有几种原因?与cDNA的量少有关吗?Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性?一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶的污染。
由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。
因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用。
3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。