RT-PCR的实验原理与操作步骤
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测基因表达水平。
其原理是通过逆转录将RNA转化为cDNA，并利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因的序列，最终定量检测目标基因的表达水平。
下面将详细介绍RT-PCR的原理。
1.逆转录（Reverse Transcription）逆转录是RT-PCR的第一步，主要是将目标基因的RNA转化为互补的DNA，即cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶（Reverse Transcriptase）和引物（Primers）的参与。
首先，待检测的RNA通过加热来解旋成为单链。
然后，在逆转录反应中，引物（Primers）结合在RNA的末端，提供一个起始点。
逆转录酶（Reverse Transcriptase）将引物作为模板，合成互补的DNA链。
引物一般选择Oligo-dT引物，它可以与RNA的多聚腺苷酸尾端结合，从而引导逆转录酶合成cDNA链。
此外，逆转录反应还需要dNTP（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液等辅助物资。
2. PCR扩增（Polymerase Chain Reaction）逆转录后得到的cDNA是目标基因的复制物。
为了增加检测敏感性，需进一步扩增cDNA序列。
在PCR扩增过程中，引物（Primers）的作用是选择目标基因的特异序列，通过引物与目标序列的互补配对，使DNA聚合酶（DNA Polymerase）能够在相应的温度下在该位置合成新的DNA链。
PCR扩增需要参与的物质有DNA聚合酶、引物、dNTP、缓冲液和模板DNA。
引物是PCR反应中的关键，其中一对引物的设计应使其能够选择性地与目标基因序列的两个位点互补，从而能够在接下来的扩增反应中产生目标DNA片段。
PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和扩增。
首先，通过高温（通常为94℃至96℃）变性步骤将目标DNA链分离为两个单链。
RT–PCR的原理及实验步骤
RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RT-PCR实验原理与步骤
RT-PCR实验原理与步骤【实验原理】RT-PCR 是以RNA 为模板经逆转录反应（Reverse Transcription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。
【实验仪器】1. 恒温金属浴2. PCR 扩增仪【试剂及配制】RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0试剂包括：1. AMV 反转录酶XL (5 U/ul)2. 10×反转录反应缓冲液3. RNAase 抑制剂(40 U/ul)4. 随机引物9 mers (50 pmol/ul)5. RNAase Free dH2O6. TaKaRa Ex TaqTM HS (5 U/ul)7. 5×PCR 反应缓冲液8. dNTP Mixture (各10 mM)【实验步骤】1. 反转录反应1）按下列组成配制反转录反应液MgCl2 2ul2. PCR 反应1）按下列组成配制PCR 反应液2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR 反应管中，轻轻混匀；3）按以下条件进行PCR 反应：94 ℃ 2 min，94℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72℃ 4 min、30 cycles，72℃ 5 min。
4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。
【注意事项】1. PCR 条件设定退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。
延伸时间因目的序列长度不同而不同。
cDNA 量较少时，循环次数可增加为40～50 次。
2. 当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。
3. 使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
4. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。
5. 分装试剂时务必使用新的Tip 头，防止样品间污染。
rt pcr原理
rt pcr原理RT-PCR原理RT-PCR是一种广泛应用于分子生物学和医学诊断领域的实验技术，其全称为反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）。
本文将详细介绍RT-PCR的原理。
一、反转录（Reverse Transcription）1. 反转录的概念反转录是指将RNA模板上的信息逆向转录成为DNA序列。
在RT-PCR中，反转录是制备cDNA（complementary DNA）模板的关键步骤。
cDNA是由RNA模板逆向合成的双链DNA，它可以作为PCR 扩增的模板。
2. 反转录过程反转录过程由三个主要部分组成：RNA逆向转录、RNA降解、cDNA 合成。
首先，需要使用反转录酶将RNA模板逆向转录为单链cDNA；然后通过碱基切除和填充，将单链cDNA变为双链cDNA；最后使用RNase H或其他酶降解RNA模板，得到纯净的cDNA。
二、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）1. PCR的概念聚合酶链式反应是一种体外扩增核酸序列的技术。
它可以在短时间内从微量样品中扩增出大量特定的DNA序列。
2. PCR过程PCR过程由三个主要步骤组成：变性、退火、延伸。
首先，将DNA 双链分离为两条单链，即变性；然后引入引物（primers），使其与目标序列的两端互相补合，形成一个模板-引物复合体；最后，使用DNA聚合酶在引物的作用下延伸新链。
三、RT-PCR原理1. RT-PCR的概念RT-PCR是一种结合反转录和聚合酶链式反应技术的方法，用于从RNA模板中扩增特定的DNA序列。
它可以将RNA转录为cDNA，并通过PCR扩增cDNA。
2. RT-PCR过程RT-PCR过程由四个主要步骤组成：反转录、初步扩增、二次扩增、检测。
首先进行反转录反应，将RNA逆向转录为cDNA；然后进行初步扩增，使用特定引物扩增目标序列；接着进行二次扩增，使用内部引物对初步扩增产物进行进一步扩增；最后进行检测，确定是否存在目标序列。
RTpcr技术的原理
RTpcr技术的原理RTpcr技术（逆转录聚合酶链反应技术），是一种基于聚合酶链反应（PCR）原理和逆转录酶（reverse transcriptase）的技术。
逆转录是一种生物学过程，它将RNA转录成相应的DNA。
这项技术在分子生物学和生物医学研究中广泛应用，特别用于病原体检测、基因表达研究和疾病诊断。
1. RTpcr技术的基本原理RTpcr技术的基本原理是先利用逆转录酶将目标RNA转录成cDNA（亦称为反转录，即逆转录），然后以cDNA作为模板进行PCR扩增。
整个过程分为两个关键步骤：逆转录和PCR反应。
2. 逆转录过程逆转录过程是RTpcr技术的第一步，其目的是将RNA转录成cDNA。
逆转录酶是这一步的关键酶类，它能够将RNA作为模板，并合成相应的cDNA。
常用的逆转录酶有AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶和Tth逆转录酶等。
逆转录过程包括以下步骤：1.首先，逆转录酶结合到引物上，在低温下发生结合反应，形成逆转录酶-引物复合物。
2.然后，复合物结合到RNA模板上，在合适的反应条件下，逆转录酶开始合成新的cDNA链。
3.在合成过程中，逆转录酶通过酶的核酸酶活性，将RNA模板逐渐降解，最终产生单链cDNA。
4.最后，通过加热反应停止并灭活逆转录酶。
3. PCR反应过程PCR反应是RTpcr技术的第二步，其目的是扩增cDNA。
PCR反应是通过三步循环反应不断倍增DNA，使其产生指数级的增加。
PCR反应包括以下步骤：1.Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开为两根单链。
2.Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物结合的温度，引物与目标序列互补结合。
3.Extension（延伸）：将反应体系温度升高至逆转录酶的最适温度，逆转录酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。
以上三个步骤循环进行，每个循环使DNA序列倍增一倍。
通过适当的循环次数，可以将最初微小的DNA片段扩增至足够数量。
RT-PCR实验
1.PCR反应基本步骤
（1）变性：高温使双链 DNA解离形成单链 （94℃，30s） （2）退火：低温下，引 物与模板DNA互补区结 合（55-60℃，30s） （3）延伸：中温延伸。 DNA聚合酶催化以引物 为起始点的DNA链延伸 反应（72℃，60s)
2.PCR体系
上游引物 下游引物 模板cDNA dNTP Taq酶(final) 0.5ul 0.5ul 0.5ul 1ul 0.5ul
(2)电泳跑胶：琼脂糖溶液凝固后，拔出梳子， 放入到电泳槽中（电泳槽中有缓冲液），取 5ul的RNA样品加入1ul的loading buffer，用 枪头吹打混匀，然后加入到凝胶上做好的加 样孔中。将电泳槽连接到电泳仪的正负极， 启动开始电泳。（ RNA电泳的电压200v，10 分钟左右，方向负极到正极）
RT-PCR实验总结
RT-PCR是从RNA中扩增目的DNA的技术，其步 骤是将RNA逆转录成cDNA，再以此cDNA为模板进行 PCR。
一.组织RNA提取 二.逆转录（RT） 三.PCR
1.操作步骤： （1）将100mg左右组织放入研钵中，加液氮将组织 研磨成粉末状，然后加1ml的Trizol（有毒，切勿 沾到皮肤上），继续加液氮，研磨成粉末状，然 后将粉末导入到离心管中，冰上5min。 （2）往离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀， 冰上5min。 （3）4℃，12000g离心 15min（冰冻离心机），取 上清液移入新的离心管中（切勿吸入离心管下层 的沉淀），然后往新管中加入等体积的异丙醇， 轻微混匀，冰上10min。
（3）评价RNA提取纯度的方法 跑胶结束后，在紫外透射分析仪中观察到三条 条带，最靠近加样孔的是28s,然后依次是18s,5s 的条带。 是否降解 a b 纯度 a b c 条带宽窄 有无拖尾现象 加样孔有无条带 28s：18s ≧2 5s条带不太亮
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提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
（一）反转录酶的选择
1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活
性相对较弱。
最适作用温度为37 C。
2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。
最适作用温度为42 C。
3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录
酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和
SuperScript U。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一
特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。
（二）合成 cDNA 引物的选择
1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝
其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源
于 rRNA。
2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。
因绝大多数真核细胞 mRNA 具有
3'端 Poly(A ) 尾，此引物与其配对，仅 mRNA 被转录。
由于 Poly(A )RNA 仅占总RNA 的 1-4% ，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3 '端最
靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的 cDNA ，导致更为特异的 PCR 扩增。
生物科研
二、实验耗材与试剂
1．RNA 提取" target="_blank" >RNA 取试剂
2．第一链 cDNA 合成试剂盒
3．dNTPmix ：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM
4．Taq DNA 聚合酶
三、实验步骤
(一) 总 RNA 的提取
见相关内容。
(二) cDNA 第一链的合成
目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for
First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1. 在0.5ml微量离心管中，加入总 RNA 1-5卩g ,补充适量的DEPC H2O使总体积达11卩l。
在管中加0卩M Oligo(dT)12-18 1卩l，轻轻混匀、离心。
2. 70 C加热0min ,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列试剂的混合物：
10 x PCR buffer --------- 2 卩1
25mM MgCl 2 -------- 2 卩1
10mM dNTPmix ------------ 1 卩1
0.1M DTT ---------- 2 卩1
轻轻混匀，离心。
42 C孵5min。
3. 加入 Superscript n 1 在l 42 C水浴中孵育 50min 。
4. 于70 °C加热15min以终止反应。
5. 将管插入冰中，加入 RNase H 1卩,1 37 C孵育20min，降解残留的RNA -20 C保存备用。
(三) PCR 扩增
1. 取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA --------- 2卩1
上游引物（10pM） ------ 2卩1
下游引物（10pM）------- 2卩1
dNTP（2mM） ------- 4 卩1
10 x PCR buffer ------------- 5 卩1
Taq 酶（2u/ 卩 I）-------- 1 卩1
2. 加入适量的ddH 2O,使总体积达50卩l。
轻轻混匀，离心。
3. 设定 PCR 程序。
在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。
为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA ，作为对照。
4. 电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
5. 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1. 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。
在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 断裂
2. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照
2.内参的设定：主要为了用于靶 RNA的定量。
常用的内参有 G3PD（甘油醛-3- 磷酸脱氢酶）、B-Actin（-观动蛋白）等。
其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4. PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。
故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5. 防止 DNA 的污染：采用 DNA 酶处理 RNA 样品，在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。
6. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180 °C的高温下干烤6hr或更长时间。
7. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
8. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡
在 3% H2O2 室温 10min ，然后用 0.1% DEPC 水冲洗，晾干。
9. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC，在37 C处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22卩山滤膜过滤除菌。
10. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换
11. 设置 RNA 操作专用实验室，所有器械等应为专用。