定量PCR的实验步骤。
定量pcr的方法
定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。
本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。
一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。
在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。
二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。
反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。
2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。
热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。
3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。
4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。
5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。
该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。
6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。
7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。
可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
环状RNA的定量PCR检测实验方法
环状RNA的定量PCR检测实验方法环状RNA（circular RNA）是一种具有闭合回路形态的RNA分子，与传统的线性RNA具有不同的生物学特性。
近年来，环状RNA受到广泛关注，研究者们致力于探索其在生物学过程中的功能和作用机制。
定量PCR是一种常用的检测方法，可以用于检测和定量环状RNA的表达水平。
下面将介绍一种常用的环状RNA定量PCR检测实验方法。
实验步骤如下：2.总RNA提取：使用RNA提取试剂盒提取样本的总RNA。
这种方法比较适用于含有较多RNA的组织样本。
使用RNA提取试剂盒可以快速、高效地提取RNA，同时避免RNase的污染。
3.线性RNA降解：使用RNase R酶可以选择性消化线性RNA，而保留环状RNA。
将提取的总RNA与RNase R酶一起反应，酶切后的线性RNA会被降解，而环状RNA则会保留下来。
4.反转录：将提取的总RNA转录成cDNA。
在这一步骤中，需要使用逆转录酶，同时加入随机引物或特异性引物，以促使cDNA的合成。
引物的选择很重要，可以使用特异性引物指向环状RNA的启动位点或者结合位点。
5.PCR扩增：将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR扩增。
选择合适的引物进行PCR扩增，引物的设计要确保特异性，并且确保在一定的温度条件下能够提供较高的扩增效率。
6.分离和检测PCR产物：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其他适用的方法，分离PCR产物。
然后可以通过染色剂或者其他化学方法进行染色，以检测PCR产物的存在和相对丰度。
7.定量PCR分析：从PCR产物中选择相对稳定和特异的片段，进行定量PCR分析。
可以使用实时定量PCR方法，通过结合荧光探针或SYBR Green等荧光染料，测量PCR反应的信号。
通过与内参基因或标准曲线法进行定量分析，可以得到环状RNA的表达水平。
需要注意的是，由于环状RNA具有闭合回路的结构，其序列中不存在5'和3'端，因此在PCR扩增过程中需要特殊的引物设计和反转录方法。
荧光定量pcr步骤
荧光定量pcr步骤荧光定量PCR(real-timePCR)一种高通量的核酸定量分析技术，用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量。
荧光定量PCR是基于反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时PCR技术，结合这两种技术，可以非常快速地检测和定量基因表达。
本文将介绍荧光定量PCR的步骤。
第一步：样品的准备与检测1.1品的准备：首先，细菌或病毒样品根据实验要求进行灭菌或病毒灭活。
1.2测：根据需要，采用适当的抗体检测样品中是否有病毒和细菌，将病毒和细菌样品中的RNA或DNA分离出来，将分离出来的核酸用于下一步检测。
第二步：荧光定量PCR反应2.1品添加：将分离出来的核酸和所需的实验试剂（如反转录酶、DNA聚合酶、定量PCR探针、模板DNA，以及相关配套试剂）混合，反应体系得到。
2.2动PCR反应：将反应体系定温热处理，使反转录酶向模板DNA 中的特定序列引物亲和，以实现反转录。
2.3入PCR探针：将定量PCR探针加入反应液中，以实现基因表达荧光定量PCR。
2.4复PCR循环：每次循环引入一定量的反应物，以实现基因表达荧光定量PCR，并在每次循环时观察荧光信号，从而实现基因表达定量。
第三步：数据分析3.1据分析：对荧光信号数据进行定量分析，实现基因表达定量，并将结果画在实验曲线上，以观察基因表达的变化情况。
3.2验结果：在实验曲线上，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为基因表达量，可以观察实验结果，以确定基因表达量的情况。
荧光定量PCR步骤是用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量的有效技术，它包括样品的准备和检测、荧光定量PCR反应、数据分析三个步骤，可以快速准确地定量检测基因表达情况，为实验中的细菌和病毒基因分析领域提供有效的参考依据。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
PCR实验室操作流程
PCR实验室操作流程PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种可以通过体外合成DNA的方法，也是现代生物技术中一项重要的分子生物学技术。
PCR技术的应用广泛，包括基因测序、基因突变检测、表达定量等。
下面是PCR实验室操作的一般流程。
1.设计引物：PCR实验的第一步是设计引物。
引物是用于扩增目标DNA片段的短链DNA序列。
两个引物分别对应目标序列的两端，其长度通常在18-24个碱基对之间。
引物的碱基序列必须与目标序列互补，以确保引物的结合和扩增特异性。
2. 制备PCR反应液：将PCR反应所需的试剂制备成PCR反应液。
PCR 反应液包括模板DNA、引物、聚合酶、反应缓冲液、dNTPs和Mg2+等。
聚合酶可以是常见的Taq聚合酶，也可以是其他高保真度的热稳定聚合酶。
反应缓冲液包含缓冲盐、pH调节剂和聚乙二醇等成分。
3.加热变性：PCR反应开始前，需要对DNA模板进行热变性，将其双链DNA解开成单链DNA，以供引物结合。
一般在95℃左右进行加热变性步骤，持续1-5分钟。
4.循环扩增：PCR实验主要包括循环扩增的步骤。
循环扩增主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
变性温度一般设置在94-98℃，可以使DNA双链变为单链；退火温度根据引物序列的特性来设计，一般设置在50-70℃之间，可以使引物与DNA模板序列结合；延伸温度一般为72℃，此温度下聚合酶能够合成新的DNA链。
5.PCR循环反复：PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸的三个步骤。
这样可以进行指数级扩增，生成大量目标DNA片段。
6. PCR产物检测：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行检测。
将PCR产物与DNA分子量标记物一起电泳，可以通过与标准品比较得知扩增片段的大小。
也可以通过染色剂如SYBR Green等进行荧光定量，或者使用定量PCR方法定量扩增产物的数量。
7.结果分析和数据处理：根据PCR产物的结果进行数据分析和处理。
荧光定量PCR实验标准操作 SOP
荧光定量PCR实验操作SOP一、实验目的通过本操作获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据，用于下一步实验结果的分析。
二、实验准备：1. 进行荧光定量PCR实验操作之前，荧光定量PCR 操作实验室需紫外灯照射15 分钟，关闭紫外灯后开启通风系统抽风15分钟。
2. 进入荧光定量PCR操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR模板污染。
3. 实验前将70%乙醇涂布于操作台及器具（移液器等）表面，两分钟后用纸巾擦除。
4. 准备实验中放污染材料的器皿、用于荧光定量PCR 实验操作的耗材（要求无菌）1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、1.5ml 离心管，用于荧光定量PCR 操作的试剂: 荧光定量PCR Master Mix、H2O，DNA 或cDNA 模板（注意必须在配制完荧光定量PCR所需MIX后才可以取出）.5. 一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
6. 实验结束后移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。
三、实验步骤：1. 荧光定量PCR MIX 的配置：在实验记录本上记录下要进行实验的样品内容、日期、实验样品孔信息（无特殊要求每样品每基因均按照3平行孔实验），然后计算出所需MIX 体积，分别加入后混匀分装至PCR扩增板，单孔荧光定量PCR孔Master Mix 按照20uL反应体系内容如下：Primer F: 0.8ul(0.4uM)Primer R: 0.8ul(0.4uM)2×TB Green Premix: 10ulROX: 0.4ulH2O: 6ulMIX Total: 18ulMIX配制通常准备10%冗余量。
2. MIX 配置好后混匀快速分装至PCR反应板，快速准确的将样品DNA/cDNA 小心加入装有反应液体的反应管内：DNA/cDNA Template: 2ul(<100ng)荧光定量PCR 反应总体积：20ul.3. 模板加好后, 盖紧盖子并做好标记, 写上编号（用防水笔书写）；4. 严格按照荧光定量PCR 仪的操作手册启动仪器，设置实验扩增程序（包含荧光定量PCR 扩增程序、荧光定量PCR 样品孔信息），保存文件，最好以日期及样品名称命。
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定量PCR的实验步骤
一、标准曲线的标准DNA样品准备
1.将目的片段进行克隆，对克隆得到的阳性菌落进行质粒DNA的提取和纯化（试剂盒），纯化后的质粒DNA纯度用DO260/DO280的比值来鉴定，纯的DNA比值应该在1.8-1.9之间，如果比值大于1.9的时候表示有RNA污染，小于1.6的时候表示有蛋白质的污染（DO260的1OD值相当于50ng/ul的双链DNA 或33ng/ul的单链DNA或40ng/ul的RNA）；
2.采用紫外分光光度法（DO260 nm）测定质粒DNA的吸光度DO260值为A，（B=1DO260=50 ng/ul），由于载体质粒序列和插入的目标片段的序列都是已知的，这样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出单个质粒DNA （阳性质粒）的分子量C (ng/mol)，进而计算标准品的拷贝数D(copy/uL)：
拷贝数D=A×B
C
×6.02×1023(copy/ul)
3.将2步骤中计算出来的已知拷贝数的质粒DNA以10倍为梯度进行稀释，稀释7个系列（各个梯度的浓度一般为101～107），作为标准曲线的DNA模板；
二、未知样品的定量标定
模板质粒DNA每个梯度设置3个平行样。
未知样品设置2个平行样，同时设置一个没有质粒DNA的阴性对照。
（定量实验，误差是不可避免的，设立平行样，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小，以满足小样本统计的要求；确保数据的有效性，排除假阳性的干扰，必须设置阴性对照，阳性对照有标准样品就做，没有标准样品就可以省略不做）；
2.按照下面的程序进行荧光定量PCR反应：
95℃ 3 min
95℃10 s
58℃20 s 40个循环
72℃20 s
95℃30 s
58℃10 s 溶解曲线，并且在72℃和58℃时候读盘。
95℃
3.程序完成后进行溶解曲线分析，确定反应过程的特异性；同时用琼脂糖凝胶电泳对定量PCR的产物进行检验；
4.根据求得的未知样品中目的基因的拷贝数E( copy/ul)以及根据相关文献记载的单个细胞中含有的目标基因的拷贝数F（copy/cell，在相关的文献中能够找到假定的每个细胞中含有的目的基因的拷贝数），进而计算出单位样品中所含有的细胞当量数CEN：
CEN=E
F
(cell/ul)
这样既对目标基因进行了定量也对细胞数进行了定量（用细胞当量数表示）荧光定量PCR为什么使用外标定量，而不是内标定量？
A、内标对实时荧光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
B、荧光定量PCR无需内标定量
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
（1）Ct值的高度重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
（2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，
得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。