基因表达载体和重组质粒的区别
基因工程专业大题
1.生物技术概念与特征定义：利用活体生物或它们的产物来生产或修饰一种产品以改良植物和动物、或发展具有特殊用途的微生物的技术。
2.基因工程的概念利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程3.PCR反应体系基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成4.PCR反应参数：高温变性(94)，低温退火（60），适温延伸（72）5.PCR反应体系：（1）模板DNA（2）特异性引物dNTP（3）耐热的DNA聚合酶（Taq酶）（4）缓冲溶液6.PCR反应原则：引物原则：（1）引物扩增跨度（2）引物解链温度（3）避免引物内部或引物之间存在互补序列（4）G+C含量：尽量控制在40%至60%之间（5）引物的3‘末端特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对（6）引物中有或能加上合适的酶切位点7.分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。
用途：（1）研究DNA之间的亲缘关系（2）发现基因的缺失或突变；（3）测定某种遗传信息的量（4）鉴定某种基因（5）基因治疗8.常用分子杂交类型：（1）DNA印迹技术Southern blotting（2）RNA印渍技术Northern blotting（3）蛋白质印渍技术Western blotting（4）斑点印迹Dot blotting（5）原位杂交in situ hybridization9.DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)10.Sanger双脱氧链终止法原理：（1）Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂，2ˊ,3ˊ-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3ˊ位又少了个羟基。
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
基因片段与载体连接、转化和重组子筛选
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养 基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
基因工程的基本操作程序——彭真课件
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多
数单子叶植物没有感染能力
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转 移到受体细胞，并整合到受体细胞染 色体的DNA上。
③转化过程:
Ti质粒
构建
表 达
转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物
插入
细
胞
植物细胞 表达 染色DNA
新 性 状
（2）子 种生种生物的 全部基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列
基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性
P15思考与探究
2、检测目的基因是否转录出了mRNA ①方法: 分 子 杂 交
②过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出 现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法——抗原-抗体杂交
Bt毒素蛋白
抗体
与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
真核细 胞的
基因结 构
外显子：能编码蛋白质的序列 编码区
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区 ：有调控作用,上游有启动子，下
游有终止子
非编码序列： 包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不同点 相同点
原核细胞
真核细胞
编码区是 _连__续__的
编码区是间隔的？
将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中，各 个受体菌分别含有这种生物的不同基 因，称为基因。基因基因组
部分基因 （cDNA）基因组DNA与cDNA的比较
重组DNA技术
（二）表达载体
表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因
的载体。
根据宿主细胞分为：
原核表达载体 真核表达载体
目录
1. 原核表达载体
原核表达载体的基本组成
R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列
目录
2. 真核表达载体
真核表达载体的基本组成
OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点； TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。
设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
目录
（一）克隆载体
1. 克隆载体应具备的基本特点
至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制； 至少有一个选择标志（selection marker）：选择标志是 区分含与不含载体的细胞所必需的，如抗生素抗性基因。 有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA
目录
2.
从基因组DNA文 库获取目的基因
组织或细胞染色体DNA
限带的所 有基因组DNA的集合
克隆载体 重组DNA分子 受体菌录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个 RE的单一切点，
可 供 外 源 基 因 插 入 时 选 择 ， 叫 多 克 隆 位 点 （ multiple cloning sites，MCS）。
载体
基因工程的载体载体的特征：在寄主细胞中能够自主复制；有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段；在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；载体分子较小，以便体外基因操作；对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；载体的类型⏹质粒⏹噬菌体⏹其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒)质粒(plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞⏹并不是所有的质粒都是环状分子, 在多种细菌中都发现有线性质粒⏹质粒广泛存在于原核生物中, 其大小从相对分子量小于1X106 到大于200X106质粒的形态1) cccDNA—双链闭合环状DNA2) ocDNA—开环DNA3) cDNA—线形DNA（L型）在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作用下解旋。
溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作用溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式. 进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向). 为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链质粒DNA的复制类型⏹严紧型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。
所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝⏹松弛型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。
如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数穿梭载体（shuttle vector) 可以在两种生物体内复制的载体分子质粒的命名规则⏹小写字母p表示质粒（plasmid)⏹p后面的两个大写字母表示发现或者构建该质粒的作者或者实验室名称⏹数字表示编号⏹例：pBR322、pET21、pGEM-T质粒的宿主范围⏹质粒只编码少数几个其自身复制所需要的蛋白质,甚至在许多情况下只编码其中一个蛋白质⏹所有其他复制所需的蛋白,包括DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶等都是由宿主细胞提供的⏹质粒所编码的复制蛋白质定位在ori 附近，因此只有ori 周围的一小部分区域是复制所必需的⏹因此，把质粒的其他部分删除掉，把外源序列加到质粒上，复制仍然可以继续进行⏹质粒的宿主范围是由它的ori 决定的质粒的不相容性⏹在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内⏹如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容显性质粒和隐蔽质粒⏹显性质粒(表达型质粒)----除了携带与本身复制和转移有关的基因外, 还携带一些其他的基因, 宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状, 这样的质粒称为显性质粒⏹隐蔽质粒----无异常性状表现出来克隆载体例：pBR322、pUC18、pUC19、pGEM-T表达载体例：pET-21、pGEX⏹质粒DNA的制备碱裂解法、煮沸法、层析柱过滤法碱裂解法原理：在高pH的碱性条件下，染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA由于其超螺旋共价闭合环状结构，尽管其DNA的大部分氢键也断裂，但是双链DNA仍然不会分离，当恢复到中性时，染色体DNA复性，并聚集形成不可溶的网架。
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
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载体，质粒，基因表达载体3者有何不同？
载体是一种运输工具，细胞膜上的蛋白质也是一种载体，其识别很单一，也因此有了选择透过性。
质粒是一种小型环状DNA，广泛存在于微生物中，一般的基因工程中，质粒被用来当做目的基因的运载体，也是一种运输工具。
基因表达载体是目的基因和运载体连接后的产物。
基因表达载体和重组质粒的区别
基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。
如果以质粒作为运载体，
首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。
然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。
将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。
这个重组的DNA分子也叫重组质粒。
就是这样。
简单的说，重组质粒是基因表达载体的一种。
生物学上marker是什么意思
从文字上说，标记（Marker），染色体上一个可以被识别的区域（比如限制性内切酶的酶切点，基因的位置等）。
标记的遗传能够被检测出来。
标记可以是染色体上有表达功能的部分（比如基因），也可以是没有编码蛋白质功能但遗传特性能够被检测出来的部分
从实验上说，marker有两种，一种是基因marker，一种是蛋白质marker。
两种marker分别是进行琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE（蛋白质电泳）所用的标准参照物，用以指示目的基因或者蛋白的大小。
一般常称呼的marker都是指基因marker，即DNA marker
DNA Marker
作为一种分子标记(Marker)，构建分子图谱。
分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。
DNA Marker 是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。
现在常用的DNA MARKER有两种，一种是病毒等DNA经过酶切获得的，分子量大小有零有整，另外一种是固定数值的，比如100BP，200BP等。
两种MARKER都不难制作，对于第一种，稍微难一些，主要是要获得病毒等大的基因组片段，然后用适当的酶切，切割完全以后，就能得到相应的图谱。
第二中实际上很简单，如果你手头有任何一个载体，而且它的序列完全清楚，那么可以采用PCR的方法获得一系列大小不同的片段，比如上游引物可以使用一个，然后用数数的方法确定下游100BP处的下游引物，扩增出的就是100BP的片段，200BP处的引物就是200BP的片段，依此类推，可以获得一系列不同大小的片段，扩增后，把它们放到一起，就获得了自制的MARKER了
RNA电泳条带中的28s 18s 5s分别代表什么？
生物体内一般含有核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转运RNA(tRNA)三种主要的RNA，其中rRNA含量最多,提取组织总RNA所得最多的就是rRNA。
真核生物中含有5S、5.8S、18S、28S,原核生物中有5S、16S、23S；而植物组织中一般较多的为5S、18S、28S
S代表沉降系数，当用超速离心测定一个粒子的沉降速度是，此速度与粒子的大小直接成比例。
5S、18S、28S分别具有120、1900和4700个核苷酸RNA 的28s/18s 指的是什么，还有，RIN怎么测定？
28s和18s是真核生物rRNA（核糖体RNA）的两个主要亚基，在体内含量较多。
RNA提取过程中可能发生各种途径的降解，28S/18S即为衡量提取的RNA完整性的指标，如果28S/18S为1.8~2.0表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生。
电泳条带上应是28S在上，18S在下，且亮度为28S是18S的两倍。
RIN 值的测定有专门的仪器，还可以产生RNA主要条带的峰图。