甲胎蛋白异质体
甲胎蛋白异质体在鉴别肝细胞癌中的应用
［ 叶应妩 ， ５ ］ 王毓 三 ，申子瑜 ． 国临床检 验操作规 程． 全 南京 ： 南
京大学出版社 ， ０ ６ ９ ． ２ ０ ：２ ６
『１ 裴忠亚 ， 涛．Ｑ Ｏ ６ 孙 Ｉ２ ０尿沉渣分辨 正确率 调查． 医学 检验 与临
影 响 白细 胞 的 检 测 。 此外 ， 尿 液 中有 大 量 细 菌 、 当 大量 红 细 胞
Ｉ ２ ０ａ ｔ ｔ ｒ ｅｍ ｃｏｃｐ ｎ ｌ ｅ ｎ ｏ ｐ ｒｏ ｉ Ｑ ０ ｕｏ ｅ ｕｉ ｉｒｓｏｙａａｙ ｒａｄ ｃｍ ａｉ ｎｗｔ ｍａ ｄ ｎ ｚ ｓ ｈ
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７２ ・ ３
实用 医技杂志 ２ １ ０ ２年 ７月第 ｌ ９卷第 ７期
Ｊｕｎ ｆ ｒｃｉａ Ｍｅ ｉ １ ｅｈ ｉｕ ｓ Ｊｌ ０２， １ １ ，Ｎ ． ｏｌ ａ ０ ａｔ ｌ ｄｃ ｃｎｑ ｅ ， ｕｖ２ １ Ｖ０． ９ ０ ７ ｒｌ Ｐ ｃ ａＴ
鳞状上皮细胞 、 细菌 、 酵母 菌 、 结晶 、 黏液丝和精子等。每种成 分均可在荧光屏上显示其形态 ． 并可任意选取可疑 的成分进 行 人工复核 ， 是一 种全新尿液有形成 分的检测技术 。但 由于 各种 因素使 尿有形 成分形态 不典 型时 、 杂质较 多 、 尿液 中含 有 形态特征较为相似 的成 分时 ， 常导致某些检测项 目存 在一
定 程 度 的结 果 误 判 （ 假 阳 性 ） 如 果 不 予 以及 时 发 现 和 纠 即 。
纳米磁珠结合核酸适配体用于检测肝癌患者甲胎蛋白异质体（AFP-L3）的研究
纳米磁珠结合核酸适配体用于检测肝癌患者甲胎蛋白异质体（AFP-L3）的研究摘要：肝细胞癌(HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一。
甲胎蛋白异质体(AFP-L3)是HCC最重要的生物标志物，广泛应用于早期筛查、诊断和预后观察。
本研究采用适配体而不是抗体作为AFP-L3 的特异性识别受体，将AFP-L3特异性的ssDNA适配体接枝到磁性纳米颗粒(Fe3O4@SiO2)，并对所得到的适配体功能化磁性纳米颗粒(Ap-MNPs)进行了充分的表征和测试。
溶液中的Ap-MNPs对外磁场的响应较快，并可在几分钟内完全分离。
结果表明，Ap-MNPs对靶AFP-L3具有较好的特异性， AFP-L3的回收率（87.0%）远高于竞争蛋白IgG（38.9%）、HSA （18.5%）和FIB（11. 4%）。
基于Ap-mnps结合高效液相色谱法(HPLC)，建立了一种简便、高效的血清中AF蛋白无标记检测方法。
本研究表明，适配体是识别和检测生物标志物的理想工具，将在临床实践中得到广泛的应用。
关键词：磁性纳米颗粒、适配体、甲胎蛋白异质体异质体、生物标志物、无标记检测1.引言检测血清中的生物标志物，旨在实现早期发现和早期发现癌症的治疗。
甲胎蛋白异质体(AFP-L3)是最敏感和最特异性的生物标志物之一。
此外，AFP-L3被认为是一种重要的临床指标来识别早期可治愈的HCC患者并减少疾病相关死亡率。
人们认为，甲胎蛋白异质体的浓度在正常状态下70人血清一般低于25ngmL- 1，而≥为500ngmL- 1可能建议恶性HCC。
因此，检测血清中的甲胎蛋白异质体对临床非常重要评估治疗结果和预后，以及复发的预测和转移。
传统的AFP-L3检测方法是基于免疫原理，e抗体与抗原AFP-L3的结合。
众所周知,该抗体热不稳定，容易变性，其活性通常是分批波动。
这些缺点将因此导致不稳定随后对AFP-L3浓度的测定不准确。
因此，特别希望寻求一种免疫分析的替代策略AFP-L3检测。
亲和吸附离心管法检测甲胎蛋白异质体用于诊断肝癌的研究
亲和吸附离心管法检测甲胎蛋白异质体用于诊断肝癌的研究邢怀广;李捷;韩善乐【摘要】目的采用亲和吸附离心管法检测甲胎蛋白异质体(AFP-L3),分析甲胎蛋白异质体AFP-L3在诊断肝癌的临床应用价值.方法选择121例甲胎蛋白AFP阳性患者血清(≥10ng/ml).使用亲和吸附离心管方法检测血清甲胎蛋白异质体AFP-L3,并且对研究对象进行跟踪,分析甲胎蛋白异质体用于临床在鉴别肝癌的作用.结果以甲胎蛋白异质体AFP-L3≥10%作为诊断指标,肝癌患者血清中甲胎蛋白异质体AFP-L3异常升高者明显高于其他肝病患者(P<0.01); 对58例临床确诊为肝癌的患者甲胎蛋白异质体AFP-L3的诊断灵敏度是79.31%;在63例临床诊断为其他肝脏疾病的患者甲胎蛋白异质体AFP-L3的诊断特异性达到92.06%,甲胎蛋白异质体AFP-L3的符合率85.95%.结论应用亲和吸附离心管法检测甲胎蛋白异质体AFP-L3在肝癌与良性肝脏病变鉴别诊断中具有重要临床价值.【期刊名称】《中国实用医药》【年(卷),期】2011(006)013【总页数】3页(P11-13)【关键词】甲胎蛋白异质体;肝癌;离心法【作者】邢怀广;李捷;韩善乐【作者单位】252004,聊城市人民医院放免室;252004,聊城市人民医院内科;莘县人民医院内科【正文语种】中文肝癌是世界上最常见的10种恶性肿瘤之一，全世界每年约有25万人肝癌［1］;肝癌发病之初较为隐匿，临床难以检出，临床诊断是一般多为晚期，治疗效果差，因此早期发现肝癌并且及时治疗可以提高患者的5年存活率。
近年随着影像学的发展，一部分体积小的肝癌患者得以及时发现，患者5年存活率有了一定的提高。
但是影像学技术检测用于诊断肝癌仍然受到很多的限制，使很多患者未能及时得到准确诊断，失去了最佳的治疗时机。
甲胎蛋白(AFP)定量检测是目前早期发现肝癌的主要血清学标志物，但是其他一些疾病也可能引起甲胎蛋白的升高，特别是属于肝癌高危监测人群的慢性肝炎、肝硬化患者［1，2］。
甲胎蛋白异质体比率（AFP-L3%）临床应用价值解析
甲胎蛋白异质体比率（AFP-L3%）临床应用价值解析甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是目前临床应用最广泛的肝癌辅助诊断血清标志物。
AFP诊断肝癌的敏感性为60%～70%，但在肝脏良性疾病，特别是肝癌高危人群，如慢性肝炎、肝硬化中也有部分患者会出现AFP升高。
妇女孕期及某些生殖系统疾病AFP也会升高。
AFP是一种单链糖蛋白，根据其与小扁豆凝集素（Lens culinaris agglutinin，LCA）的亲和力从低到高依次分为AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。
AFP-L1主要见于良性肝病，AFP-L2主要由卵黄囊产生并多见于孕妇，而AFP-L3主要来源于肝癌细胞，也被称为甲胎蛋白异质体。
中国、日本及亚太肝癌诊疗指南中均将AFP作为肝癌的监测指标。
日本肝病学会（Japan Society of Hepatology，JSH）制定的肝癌诊疗指南中建议将AFP、AFP-L3和异常凝血酶原[脱γ羧基凝血酶原（des-gammacarboxyprothrombin，DCP），又称维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白质（protein induced by vitamin K absence or antagonistⅡ，PIVKAⅡ）]同时作为肝癌筛查的标志物，并建议高危人群每6个月做一次超声检查及AFP/AFP-L3/DCP检测以筛查肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），超高危人群及预后随访则建议每3～4个月进行1次AFP/AFP-L3/DCP及影像学检查。
我国原发性肝癌诊疗规范（2011年版）中指出：血清AFP及其异质体是诊断肝癌的重要指标和特异性最强的肿瘤标志物，国内常用于肝癌的普查、早期诊断、术后疗效监测和随访，且有助于鉴别肿瘤的来源。
尽管美国肝病学会（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）并未将血液标志物纳入临床肝癌诊疗指南，但美国食品与药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）已于2005年批准AFP-L3检测试剂和方法用于临床肝癌预警。
甲胎蛋白异质体比率和血清异常凝血酶原联合检测对肝细胞癌的临床诊断价值
甲胎蛋白异质体比率和血清异常凝血酶原联合检测对肝细胞癌的临床诊断价值肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，具有高发病率和死亡率。
早期的肝细胞癌常常没有明显的临床症状，因此很难及时发现和诊断。
目前，临床诊断肝细胞癌的方法主要包括肝脏超声检查、CT、MRI等影像学检查，以及血清标志物检测。
而甲胎蛋白（AFP）和异常凝血酶原（DCP）是常用的肝细胞癌的血清标志物。
单一指标的检测具有一定的局限性，因此研究者们开始探索多种标志物的联合检测方法，以提高对肝细胞癌的诊断准确性。
本文将介绍甲胎蛋白异质体比率和血清异常凝血酶原联合检测对肝细胞癌的临床诊断价值。
一、甲胎蛋白异质体和血清异常凝血酶原简介甲胎蛋白是一种胚胎发育时期细胞产生的一种球蛋白，是一种特定的肿瘤标志物，目前主要用于肝癌、卵巢癌和睾丸肿瘤的筛查和辅助诊断。
DCP是凝血酶原的异常合成产物，其水平与肝癌的恶性度和预后密切相关。
甲胎蛋白和异常凝血酶原作为肝细胞癌的血清标志物，已经被广泛应用于临床诊断中。
甲胎蛋白的测定是目前肝细胞癌的一项非常重要的诊断指标。
一般来说，AFP水平在肝细胞癌患者的血清中明显升高。
由于其在其他一些肝病和非肝病病人中也会偶有升高，因此其特异性不高。
DCP在肝癌发生时有所上升，且其水平与肿瘤的恶性程度和预后有一定的相关性。
甲胎蛋白和异常凝血酶原的联合检测能够提高肝细胞癌的诊断准确性。
研究表明，甲胎蛋白异质体与肝癌的发展和预后密切相关。
在肝细胞癌患者中，一般有2种甲胎蛋白异质体（L3和L1）。
L3型甲胎蛋白以高分泌异常凝血酶原（DCP）为特征，在肝细胞癌患者中高度表达，而L1型甲胎蛋白以低分泌 DCP 为特征。
相关研究表明，对于不同亚型的肝细胞癌患者，甲胎蛋白异质体比率不同，因此其测定能够在一定程度上提高对肝细胞癌的诊断准确率。
甲胎蛋白异质体比率和血清异常凝血酶原联合检测已经被广泛应用于肝细胞癌的临床诊断中。
一些研究发现，联合检测患者的甲胎蛋白异质体比率和血清异常凝血酶原水平，能够提高对肝细胞癌的早期诊断率和准确性。
甲胎蛋白异质体_AFP_L3_检测技术的研究进展
1前言甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是一种单链糖蛋白。
1970年Purves对肝癌患者血清作凝胶电泳时最先观察到AFP有不同的迁移率，因此提出甲胎蛋白异质体（alpha-fetoprotein variants）这一概念［1］。
随着生物化学及其相关分析技术的发展，研究人员发现不同来源的AFP，其糖链的组成和构型存在差异。
不同的植物凝集素能够特异性地识别一定的糖基，并与之结合。
根据与外源性凝集素亲和性的不同，可对AFP 的来源作出判断。
Taketa等［2］发现原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血清中AFP与小扁豆素（lens culinaris agglutinin，LCA）结合后，电泳分成三带，依次命名为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，即LCA非结合型（AFP-L1、AFP-L2）和LCA结合型（AFP-L3）。
对比分析显示HCC患者AFP-L3比率比其它良性肝病患者明显升高。
现通常把与小扁豆素结合的AFP-L3称为AFP异质体，它是新一代的肿瘤标志物［3］。
2甲胎蛋白异质体（AFP-L3）检测的临床意义AFP属于胚胎性蛋白，是应用最广泛的肿瘤标志物。
大量研究证实，AFP分子的糖链异质性与其组织器官来源有关，不同生理病理状况可产生不同糖链结构，并且具有肿瘤特异性。
血清总AFP所含AFP-L1来自良性肝病，占其主要部分；AFP-L2来自孕妇；而AFP-L3则为肝癌细胞特有，AFP-L3>15%即可诊断为原发性肝癌。
AFP-L3诊断肝癌的敏感性为96.9%，特异性为92.0%，准确性为95.5%［4］。
AFP-L3值与总AFP 值无相关性，是独立于总AFP值的肝癌诊断因子［5］，是目前公认的肝癌鉴别诊断和早期诊断的指标，具有非常重要的临床意义［6］。
3甲胎蛋白异质体的检测技术测定AFP-L3常用的方法，是根据AFP异质体对植物凝集素（如小扁豆凝集素LCA、刀豆素ConA或豌豆凝集素PSA）结合能力的不同进行分离，然后应用免疫学方法进行定量测定。
甲胎蛋白异质体
强调肝癌的早期发现，早诊早治
肝癌所处阶段与预后之间的关系
早期
中间阶段
进展期
终末期
标准治疗 方案
单结节/3个结节= 3cm；无 卫星灶；无肝外转移 Child-Pugh A
根治性治疗：切除 及/或肝移植
多结节；无肝外 转移
化疗
门脉受累；肝外 转移
Sorafenib
Child-Pugh C
对症治疗
预期生存 时间
近年来有报道指出,以上述标准诊断原发性肝癌,敏感性为39-64%, 特异 性为76-91%, 对早期肝癌具有9-32%阳性预测值
有近1/3的HCC患者AFP为阴性（敏感性不足），同时20-50%的慢性肝炎、 肝硬化也合成AFP（特异性不足）, 这给HCC的诊断带来了困难。
特异性 不足
20-50%的慢性 肝炎、肝硬化 也合成AFP
肝癌标志物：
➢ 甲胎蛋白（AFP）测定
➢ 血清酶等其他肿瘤标记物检查
• 由于缺乏特异性，只作辅助诊断，如碱性磷酸酶、γ-谷胺酰转肽酶、乳酸脱氢酶的某些 同工异构酶
• 谷氨酰转肽酶（GGT）及其同工酶、α-L-岩藻苷酶(AFU)、异常凝血酶原（DCP）、高尔 基体蛋白 73(GP73)，5－核苷酸磷酸二酯酶(5'NPD)同工酶、醛缩酶同工酶 A（ALD-A） 和胎盘型谷胱甘肽S-转移酶（GST）等，还有异常凝血酶原（DCP）、铁蛋白(FT)和酸性 铁蛋白(AIF)等。部分 HCC 患者，可有癌胚抗原（CEA）和糖类抗原CA19-9等异常增高。
14
如何使用这一指标？
a.分别测定样本中总AFP浓度及其异质体AFP-L3的浓度 b.计算AFP-L3占总AFP比率（AFP-L3/AFP）
甲胎蛋白异质体测定对原发性肝癌诊断的作用
【 ｂ ｔ ｃ ｂ ｅｔ ｅ Ｔ ｖ ｌａ ｅｕｅ ｌ ｓ ａ ｅ ｐｏ ｉ ｖ ｒ ｎ （ Ｆ —３ ｉ ｅｒ Ａ ｓ ａ ｔ ０ ｊｃｉ ｏｅ ａ ｔ ｔ ｓｆ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｓｉ ｏ ｍ ｍｅ ｄｆ ｅｍ ａ ｒｍｅｔ ｆ ｌ — ｔ ｒｔ ｎ ａｉ ｔＡ ＰＬ ） ｎ ａ ｙ ｒ Ｊ ｖ ｕ ｅｈ ｕ ｅ ｎ ｒ ｎ ｕ ｈ ｏｔ ｕ ａ ｈ ｆｏ ｅ ａ ｌ
Ａ ＰＬ 对 肝癌和 良性 肝病 的诊 断具有重 要 意义 。 Ｆ —３
【 关键 词】 甲胎蛋 白异质体 ；原 发性 肝癌 ；肝硬 化 ； 慢性 肝炎
中图分 类号 ：Ｒ３ ． ７５ ７ 文献标 识码 ：Ｂ 文章编 号 ：１７－ １４ （０ ０ ６ ０ ８－ ２ ６ １ ８ ９ ２ １ ）３－ １０ ０
ｗａ ｎｎ ｒｂｎｇ ｖ ｒ ｉ ａｅａ ｄｐｉ ｒ ｖ ｒ ａ ｃｒＭｅｈ ｄ ｈ ｃｏｐｎｏｕ ｃｕ ｌ ｔ ｎ ｕｉａｉ ａｇｕｉｉ Ｌ Ａ） ｓｕｅ ｏａｅ ｎ ｉｇｆ ｅｉｎｌ ｅ ｓ ｓ ｎ ｒ ｙｌ ｅ ｎｅ． ｔｏ ｓＴ ｅｍｉｒｓ ｉｃｌｍ ｏ ｐｅ ｗｉ ｌ ｓｃｌ ｒ ｇ ｌｔ ｎ（ Ｃ ｗａ ｓｄｔ ｉ ｌ ｏ ｉ ｄｅ ｍａ ｉ ｃ ｄ ｈｅ ｎ ｓ ｎ ｏｓ ｔ
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甲胎蛋白异质体
甲胎蛋白异质体（Variants of AFP or molecular heterogenetic of AFP ）是一种单链糖蛋白，含糖量约为4％左右。
不同组织细胞合成的AFP，其糖链结构有所不同，对植物凝集素的结合能力也不相同，此种糖链结构不同的AFP称为AFP的亚型或变异体，也称为AFP分子异质体。
近年来对AFP异质进行了电泳、糖链结构及与植物凝集素结合能力等方面进行了深入研究。
有资料表明，AFP异质体存在着分子大小和电荷量的差异。
淀粉胶电泳将人肝癌血清AFP分为4种亚型；用SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳发现AFP可分为分子量72kD和kD两种成分；等电聚焦结合交叉免疫电泳可使胎儿AFP分成10种等电点不同的异质体。
这表明AFP异质体存在着电泳不无一性，这与其一级结构差异有关。
其C－末端结构基本相同，N末端至少有3种不同结构，这能否产生AFP电泳异质性有待于证实。
AFP结构中的糖链主要由甘露糖、半乳糖、N－乙酰葡萄糖和唾液酸，并以寡糖单位的形式组成。
AFP 异质体糖链结构的差异主要表现在分支结构的不同，刀豆素A（ConA）结合型和非结合型AFP异质体的糖链结构模型差异表现在一个分支中有无－GLcNAc-Gal-NeuNAc结构。
对人肝癌AFP糖链结构电泳研究发现，其寡糖分为中性（N）、酸性（A1，A2）三种成分。
进一步研究证实N两分支末端均由半乳糖组成，A1两分支末端分别为半乳糖和N－乙酰神经氨酸，A2则均为N－乙酰神经氨酸。
卵黄囊肿瘤的AFP其ConA亲和性组占50％左右，肝癌腹水中与LCA结合的AFP糖链中具有与Asn连接的N－乙酰基葡萄糖胺残基，而在非结合型异质体的糖链中无此成分。
根据AFP与外源性凝集素（Lectin）结合能力的差异，可分为不同的变异体。
采用扁豆凝集素（LCA）／刀豆素A亲和电泳或层析技术能将AFP分为LCA／ConA非结合型AFP （AFP－N－L／AFP－N－C）和LCA／ConA结合型AFP（AFP－R－L／AFP－R－C）两种。
新的Lectin的应用，使AFP在糖链结构上异质体达9种之多。
AFP异质体的命名方法为：从阴极开始在LCA亲和电泳上AFP的条带依次为L1、L2、L3；在E－PHA亲和电泳上AFP的条带依次为P1、P2、P3、P4、P5；用ConA时按AFPC1、C2命名；alloA时按AFPA1、A2、A3命名。
AFPL2、L3完全不能分离，存在中间成分时按AFPL2、L3命名，AFPP4、P5分离不充分时命名为AFP－P4＋AFP－P5。
因此，AFP对不同的Lectin反应所表现的异质体不同，故可用于疾病的鉴别诊断。
AFP异质体亲和交叉免疫电泳检测法
【原理】
根据AFP对刀豆素（ConA）或小扁豆凝集素（LCA）结合能力的不同，可区别原发性肝细胞癌与非原发性肝癌引起的AFP升高，提高AFP对肝癌的诊断价值。
此法原理是将检样于含LCA的琼脂糖凝胶中电泳，与LCA结合型AFP在电泳时被阻留，而非结合型AFP 则向阳极侧泳动。
然后，与首次电泳的方向垂直，在含抗AFP的琼脂糖胶中作第二次电泳。
此时被首次电泳分离的AFP异质体，将分别于含抗AFP的凝胶板中形成沉淀峰,根据峰的大小即可了解结合型或非结合型AFP所占的比例。
【试剂】
1．小扁豆凝集素（LCA）。
2．抗AFP血清：同ELISA法。
3．10.0g/L琼脂糖：琼脂糖1.0g加0.25mol/L pH8.6巴比妥缓冲液100ml，沸水浴中使溶，加入NaN3使达1.0g/L，按需要量分装后密塞，4℃保存。
4．125I－AFP。
【试剂】
1．小扁豆凝集素（LCA）。
2．抗AFP血清：同ELISA法。
3．10.0g/L琼脂糖：琼脂糖1.0g加0.25mol/L pH 8.6巴比妥缓冲液100ml，沸水浴中使溶，加入NaN3使达1.0g/L，按需要量分装后密塞，4℃保存。
4．125I－AFP。
【操作】
1．将10.0g/L琼脂糖融化后，在6cm×12cm洁净玻板之一侧浇注2cm×12cm（厚1.6cm）凝胶条（约需3.84ml凝胶液），凝固后于距内缘2～3mm处切割一0.5cm×10cm的槽。
2．用巴比妥缓冲液将LCA稀释成2mg/ml（－20℃可保存1个月），取80μl加入冷至56℃的已融化琼脂糖凝胶1ml中，混匀后浇注于上述槽中。
待凝固后，于此胶条上距阴极端0.5cm处打一直径0.2～0.3cm的孔，距此孔4.5cm处打第二个孔（第二份检样）。
3．两孔内各加一份待测血清，加样量5～10μl。
以1.0g/L溴酚蓝为指示剂，10V／cm 稳压电泳，至白蛋白泳出4cm时关闭电源。
4．将抗AFP血清按效价与融化并冷至56℃的琼脂糖胶液混合（琼脂糖最终浓度为9.0g/L，抗AFP达最适浓度），并浇注玻板的其余部分（4cm×12cm），约需含抗血清胶液7.68ml，使凝固。
5．于LCA胶条下1.5mm处空白凝胶内切割一0.2cm×10cm的细槽，槽内注入混有1.0g/L 溴酚蓝5μl的125I－AFP 20μl（约6万～7万cpm）。
如混入0.35ml融化的10.0g/L琼脂糖胶液中浇注更好。
10V／cm稳压电泳，电泳方向与第一次电泳垂直。
至白蛋白泳出4cm时终止。
6．电泳结束后，用滤纸覆盖于凝胶板表面，置37℃干燥后，于暗室覆盖X光底片，室温曝光48h，显影，定影后观察。
【结果判断】
将X光胶片置坐标纸上，以峰两侧水平线作基线，峰形下总面积（小格数）为100％，各所占面积（小格数）与总面积的百分比即AFP异质体的百分比。
AFP异质体亲和电泳免疫印迹法
【原理】
将含AFP的待检血清置于含LCA的琼脂糖凝胶中电泳。
LCA结合型AFP泳动速度慢，而CA非结合型AFP泳动速度快，形成前后2条区带。
用吸附有抗人AFP抗体的硝酸纤维素（NC）膜进行免疫印迹，再依次与酶标记抗人AFP抗体和酶底物反应则显色。
NC膜上可呈现2条着色区带，透明后用光密度计扫描，得出结合型与非结合型AFP所占百分比。
【试剂】
1．小扁豆凝集素（LCA）。
2．马抗人AFP抗体。
3．兔抗人AFP－HRP。
4．结合马抗人AFP抗体的硝酸纤维素膜（简称马抗人AFP－NC膜）；将NC膜剪裁成与凝胶板相同大小，浸于最适稀释浓度的马抗人AFP抗体溶液中，5min后取出，电吹风吹干，4℃保存，4周内稳定。
5．洗涤液：150mmol/L NaCl溶液，含0.05% Tween-20。
【操作】
1．用25mmol/L Tris-巴比妥缓冲液（pH 8.6）配制10g/L琼脂糖凝胶（内含2.0g/L LCA），浇注玻板。
凝胶厚度为1.0mm，长8cm，宽度视标本数而定，一般为1cm宽／每份标本。
在负极侧0.5cm处，切一条7mm长、1mm宽的加样槽，槽内加待检血清4μl。
电压15V／cm，电泳45min。
电泳毕，取下琼脂糖凝胶板。
2．将马抗人AFP－NC膜先用蒸馏水浸湿，仔细地覆盖于琼脂凝胶板上，再在NC膜上加数层滤纸，上面置10g/cm2的重物。
约经30min，凝胶板上AFP电泳区带即转印至NC 膜上。
3．将免疫印迹的NC膜浸入用20g/L牛白蛋白溶液最佳稀释的兔抗人AFP－HRP溶液中，37℃，经1h后取出。
NC膜用洗涤液洗3次。
最后将NC膜浸入酶底物溶液（DAB＋H2O2）中，待显现出二条棕黄色区带后，用蒸馏水冲洗数次，终止反应。
4．在阴极侧的区带为LCA结合型AFP；阳极侧的区带为LCA非结合型AFP，NC膜在空气中干燥后，用十氢萘透明，用光密度计在波长490nm扫描，打印出二条区带的百分数。
【参考值】
阴性
【临床意义】
1．AFP是一种糖蛋白，其寡糖链有多样性，AFPV与植物血凝素中的小扁豆以集素（Lens culinaris agglutinin, LCA）亲和力不同，而分为LCA亲和的（LCA－R）和与LCA非亲和（LCA －N）的两部分，原发性肝癌的AFP糖链中存有异质体。
2．AFPV检测能鉴别良恶性肝病，如LCR－R≥25％者多数（80％以上）为原发性肝癌。
LCA－N高者为良性肝病，如急慢性肝炎，肝硬化等。
3．对病程预后的判断：如肝癌切除后，AFPV随AFP转阴而消失，若AFP未转正常，但甲胎异质体含量明显下降的患者复发的危险性少，而AFP含量下降，AFPV含量相对恒定者，则术后容易复发。
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