SNP检测详细步骤
生物样本的单核苷酸多态性(SNP)位点检测--高通量飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)
生物样本的单核苷酸多态性（SNP）位点检测--高通量飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）1 适用范围本标准为检验实验室进行药物靶点基因的检测提供技术指导。
本标准适用的样本包括：全血标本、石蜡包埋组织、干血片、口腔拭子、唾液等。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)，（2015年国家卫生和计划生育委员会医政医管局国卫医医护便函〔2015〕240号）个体化医学检测微阵列基因芯片技术规范（国家卫生计生委办公厅，国卫办医函〔2017〕1190号）感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南（国家卫生计生委办公厅，国卫办医函〔2017〕1190号）农业部1782号公告-12-2012 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的通知(卫办医政发〔2010〕194号)3、术语和定义3.1 rs和ss体系SNP由美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）建立、dbSNP数据库制定的SNP命名体系，rs体系的SNP代表已获得官方认可和推荐的参考SNP（reference SNP），ss体系的SNP代表用户新递交但尚未得到认可的SNP（submitted SNP）。
3.2 单核苷酸多态性（SNP）是指由单个核苷酸-A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。
3.3 等位基因（allele）一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态的一对基因。
若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说是纯合子。
SNP检测技术
PCR-RFLP原理图
单链构象多态性(SSCP)
原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。 特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突 变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体 位置。
PCR-RFLP方法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性， 用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片 断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位 点。 特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该 限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的 方法之一.
MassARRAY技术流程：
应用：
1. 确定基因多态性和疾病的关系 2. 解释个体间的表型差异对疾病的易感程度 3. 对未来疾病做出诊断 4. 研究不同基因型个体对药物反应的差异，指导 药物开发及临床合理用药 5. 个体间SNP千差万别，通过SNP检测等技术进 行法医鉴定及个体识别
一、 SNPs经典检测方法
一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方 法,如: 1 . 限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP ; 2 .单链构象多态性法 PCR- SSCP ; 3 . 变性梯度凝胶电泳 ( dena t ur i ng gradient gel eletrophoresi s DGGE ); 4 .等位基因特异性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等
SNP检测方法(讲课版)2
3.以构象为基础的方法
单链构象多态性( single strand conformational polymorphism ,SSCP) 温度梯度凝胶电泳( temperature gradient gel electrophoresis ,TGGE) 变性梯度凝胶电泳( denaturing gradient ge electrophoresis ,DGGE) 变性高效液相色谱检测 ( denaturing high performance liquid chromatography ，DHPLC)
CCR(combined chain reaction )
1
基本步骤
1、DNA模板的变性 2、引物和单链模板间的退火 3、DNA聚合酶(无5′- 3′外切酶活性) 催 化引物延伸 4、延伸引物的3′端和下游引物5′端间 的连接。
2
优点：
1.快速简单，仅需DNA 的分离、CCR 扩增、 琼脂糖凝胶电泳检测产物几步 2. 产生的产物片段大, 通过琼脂糖凝胶电泳 就可实现对产物的检测（不需引物标记 等繁琐技术）
20
基本原理和步骤
1.质谱分析在样品分子离子化后,根据不同离子间 的质荷比的差异来分离并确定分子量，很容易 将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开。 2.样品来源可以是PCR 产物、引物延伸反应、入 侵者酶切产物等,通过质谱可直接检测样品或探 针的不同质量,推导出样品的SNPs. 3.利用质谱分析一个样品只需几秒钟, 具有快速、 准确、自动化程度高和高通量等特点. 5.主要的问题是需对分析样品进行纯化后才能检 测。
3
LRCA (ligation-rolling circle amplication）
SDS7.SNP筛查标准实验流程
SNP筛查标准实验流程2 x TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒配合20 x TaqMan SNP Genotyping Assays试剂盒1．D NA、引物及探针用量DNA：纯度OD260/OD280=1.6-2.0；浓度1-20 ng/µL引物和探针：Primers/Probes Mix 贮存液（20×）工作液（1×）每反应用量6-FAM Probe 4 µM 200 nM 5.0 pmol/Rxn VIC Probe 4 µM 200 nM 5.0 pmol/Rxn Forward Primer 18 µM 900 nM 22.5 pmol/Rxn Reverse Primer 18 µM 900 nM 22.5 pmol/Rxn2．PCR反应试剂用量（µL/Rxn）2 × TaqMan Universal PCR Master Miix, no AmpErase UNG 12.5020 × SNP Genotyping Assay Mix 1.25DNA(1-20 ng/µL) 1.00H2O 10.25 总体积25.00a循环参数：(50°C × 2 min →)b 95°C × 10 min → (92°C c × 15 sec → 60°C × 1 min) × 40循环注：a. 对于7500Fast系统，标准反应体系为20 µL。
b. 根据PCR Master Mix中有无UNG酶决定是否增删开始的50 °C × 2 min步骤。
c. 如果使用Primer Express软件设计的引物和探针，变性温度应调整为95 °C。
SNP检测工艺(建工)
原理图
单链构象多态性()
原理：单链 在中性条件下会形成二级结构，不同的 二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖 于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导 致在凝胶上迁移速度的改变。
一、 经典检测方法
一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方 法,如:
. 限制性片段长度多态性法 ;
.单链构象多态性法 ;
. 变性梯度凝胶电泳 (
);
.等位基因特异性 ( , )等等
方法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性， 用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一片 断，如果存在位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否位 点。
变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条
带。
等位基因特异 ( )
原理：根据 位点设计特异引物,其中一条链(特 异链)的′末端与 位点的碱基互补(或相同) , 另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此 技术是一种基于的标记。因为特异引 物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没 有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增 产物的有无,从而确定基因型的 。
测 序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其
检 出率可达。
特点：可以得到 的类型及其准确位置等分 型所需要的重要参数。
基因芯片技术( )
原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的 载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好 的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出 待测序列的碱基类别。
度不同的原理,通过梯度变性胶将 片段分开
snp鉴定流程
SNP（单核苷酸多态性）鉴定是研究基因变异和关联分析的重要方法。
SNP鉴定流程主要包括以下几个步骤：
1. 样本收集与DNA提取：从生物体（如血液、组织、细胞等）中提取DNA。
2. 基因组DNA定量：使用spectrophotometer（分光光度计）或其他相关设备，对提取的DNA进行定量，确保实验过程中的DNA浓度一致。
3. 基因组DNA酶切：根据实验需求，选择合适的酶切酶，对DNA进行酶切。
酶切后的DNA片段长度分布均匀，便于后续实验操作。
4. 连接酶切片段与荧光标记的适配子：将酶切后的DNA片段与荧光标记的适配子连接，形成复合物。
该步骤为后续杂交和检测打下基础。
5. 杂交与洗涤：将制备好的复合物在特定设备（如杂交箱）中进行杂交，然后洗涤去除未结合的荧光标记适配子。
6. 荧光检测与数据分析：将洗涤后的样本置于荧光检测设备中，检测荧光信号。
根据荧光信号的强弱，分析样本中的SNP位点。
7. 结果验证与分析：对检测结果进行验证，如PCR扩增、测序等。
进一步分析SNP位点的分布、频率等，探讨其与疾病、表型等因素之间的关系。
snp检测金标准
SNP检测金标准一、样本采集样本采集是SNP检测的关键步骤之一。
为确保样本的真实性和可靠性，应遵循以下原则：1.采集样本时应根据研究设计确定合适的样本量，并确保样本具有代表性。
2.采集样本时应使用无菌、无污染的器械和试剂，并严格遵守操作规程。
3.采集样本后应立即进行实验，以确保检测结果的准确性。
二、实验设计实验设计是SNP检测的关键环节之一。
为确保实验结果的准确性和可靠性，应遵循以下原则：1.根据研究目的和实验条件选择适当的实验方法，如基于芯片的基因分型、基于PCR的SNP检测等。
2.根据实验数据确定实验方案，包括实验样本的分组、实验操作的流程、实验数据的记录和分析等。
3.根据实验条件选择合适的实验仪器和试剂，并确保其质量和可靠性。
三、数据分析数据分析是SNP检测的关键步骤之一。
为确保数据分析的准确性和可靠性，应遵循以下原则：1.使用经过验证的数据分析方法，如单因素方差分析、卡方检验等，对实验数据进行统计分析。
2.对实验数据进行去噪和质量控制，如去除异常值、对缺失数据进行插补等。
3.根据统计分析结果对SNP进行基因分型和基因型频率统计，并对其与疾病的关联性进行分析。
四、验证和确认验证和确认是确保SNP检测结果准确性和可靠性的重要步骤。
应进行以下验证和确认：1.对实验数据进行内部验证，如重复实验、对同一份样本进行多次检测等。
2.对实验数据进行外部验证，如使用不同方法对同一份样本进行检测、比对不同实验室的检测结果等。
3.对SNP检测结果进行基因型真实性和可靠性的确认，如对阳性样本进行基因测序等。
五、参考标准为确保SNP检测结果的准确性和可靠性，应使用经过权威机构认可的参考标准。
参考标准可以包括以下内容：1.SNP数据库（如dbSNP）中经过权威机构认可的SNP序列和基因型信息。
2.经过权威机构认可的SNP检测试剂盒和实验方法。
3.经过权威机构认可的SNP基因型频率统计数据和关联性分析结果。
4.其他经过权威机构认可的SNP检测相关标准和指南等。
SNP突变点检测方法进展( 完整版)
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
1
2 3 4 5
简 特 经 直
便 异 济
准确
观
一般DNA实验室能满足实验 要求
Tagman探针技术（分子信标、分子灯塔） 实时荧光PCR技术 SYBR Green Ⅰ法（结合熔解曲线分析） 芯片分析（微阵列杂交实验技术）
特异性高；
引物设计简单； 反应条件易于优化；
分辨能力高。
随着科技的进步，SNP突变点检测方法在继续改进演 变。我们选择经济实用的技术方法来满足自己所做课题需 求。就目前来说，SNP检测技术手段还有待进一步提高。 科研在呼唤着一种最为理想的SNP检测方法，其能具 备以下优点: 1. 适合自动化操作, 简便快速;
基于PCR
荧光标记检测
相 关 技 术
寡核苷酸连接 分析
基于物理技术
内切酶酶切技 术
其它
单链构象多态性（SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
变性高效液相色谱分析技术（DHPLC）
(一)PCR-SSCP
1. 基本原理:
经PCR 扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经 高温处理使之解链并保证在单链状态下,然后在一定浓度 的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳。相同长度的单链DNA , 可以因其顺序或单个碱基差异,所形成的空间构象就会不 同,其在凝胶中泳动速度不一样,从而显示出带型的差异, 即多态型
20bp
优势
局 限 性
序列多态性座位中大约只有1/3的
碱基涉及限制酶识别序列；
遗传标记系统的个人识别能力有限； 限制酶消化条件较高。
微测序技术（SNaPshot）
焦测序技术（Pyrosequencing）
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SNP检测(中文)
Part I：样本基因组DNA的提取
1.取50 μl血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5mL，轻轻地摇匀。
冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。
重复洗2次。
2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl，15 μl的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。
3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。
4.冷冻离心机12000 rpm离心10min。
5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。
6.用等体积的氯仿再抽提一次。
7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60min。
8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。
9.加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。
冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。
10.沉淀于100 μl超纯水中。
11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。
Part II：SNP分型检测
1.引物的设计与合成
(1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成；
(2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成
2.PCR扩增片段
(1)PCR扩增体系：
Components Volume (μl)
DNA template1
PrimeSTAR0.5
dNTPs (2.5 mM)1
Primer-F (10 μM)1
Primer-R (10 μM)1
5*PS buffer(Mg2+)10
ddH2O1
(2)PCR扩增程序：
(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。
B. 酶切法：一般这种方法都有文献支持，在前期可以确定好对应的内
切酶。
根据内切酶的反应体系将PCR产物进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
根据酶切条带来统计分析各个样本下该SNP的基因型。
Part II 标签SNP检测
1.引物的设计与合成
根据基因的序列设计扩增片段引物并合成。
2.PCR扩增片段
(1)PCR扩增体系：
Components Volume (μl)
DNA template1
PrimeSTAR0.5
dNTPs (2.5 mM)1
Primer-F (10 μM)1
Primer-R (10 μM)1
5*PS buffer(Mg2+)10
ddH2O1
(2)PCR扩增程序：
(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)将目的条带进行切胶回收纯化测序，将测序结果与NCBI库进行比对，找出各个样本目的基因突变的位置和形式，对结果进行汇总分析，计算某一种突变所占的百分比，根据结果找出关联性很强的几个突变位点，即为标签突变位点。
将这些突变位点与NCBI中SNP库进行比对分析，找出新发现的突变位点，可用于后续的验证和研究。