Affymetrix全基因组SNP芯片检测
SNP芯片数据分析
Affymetrix SNP芯片数据分析方案项目一、基本分析包括：芯片原始数据的处理和基因分型，我们给出有统计意义的SNP列表。
描述性统计，如minor allele frequency，Hardy-Weinberg equilibrium等。
显著性检验，实验组与对照组的差异，假阳性率（FDR）的计算等。
SNP的关联分析，建立线性模型或logistic回归模型等。
(所有的统计可以选择由SAS，SPSS，或S-Plus/R给出)项目二、Copy Number Variation（CNV）的计算。
CNV是目前的一个热点研究内容。
SNP芯片数据可以用于精确地计算CNV。
我们提供针对SNP芯片的基于CNAG(Copy Number Analyser for GeneChip), dChip(DNA-Chip Analyzer)和CNAT(Chromosome Copy Number Analysis Tool)等算法的CNV计算结果。
项目三、SNP注释通过SNP在染色体上的位置，利用寻找SNP可能影响的基因( or EST)。
我们也可以对相应基因进行功能的注释（gene ontology ，pathway和转录因子分析等），进而解释SNP可能的作用机理。
该部分可以参考常规表达谱芯片的分析。
项目四：基于模式识别的SNP挖掘传统的SNP挖掘使用统计学的方法来进行，往往在敏感性与特异性上有一定的限制。
利用一些模式识别/机器学习的方法可以更好解决SNP筛选问题。
我们提供基于决策树等SNP挖掘算法。
Hsiang-Yu Yuan et al. FASTSNP: an always up-to-date and extendable service for SNP function analysis and prioritization. Nucleic Acids Research 2006 34(Web Server issue):W635-W641项目五：诊断模型建立利用筛选到的SNP建立人工神经网络（ANN）、SVM、PAML等诊断模型，在临床上具有重要意义。
SNP开发验证的研究方法和技术路线
SNP开发/验证的研究方法和技术路线1分子标记：分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。
现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。
即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP 标记。
1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片：一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。
可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。
在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。
在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。
目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。
而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。
但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。
番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。
另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。
因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。
虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。
总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。
即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。
1.2全基因组SNP—Douglas：当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，页脚内容1我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。
SNP分析原理方法及其应用
SNPs检测方法
1.理想的检测SNPs的方法 的方法
——发现未知的SNPs，或 或检测已知的SNPs
(1) 灵敏度和准确度的要求 (2) 快速、简便、高通量 高通量、自动化 (3) 费用低廉
动脑筋的技术活，有意思 有意思，有趣，形式万变; 掌握基本原理,本质不离其中 本质不离其中
SNP分析原理方法及其应用 分析原理方法及其应用
卢大儒 复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室
遗传分析内容
n
基因组: 染色体水平 DNA水平 基因突变 重复 重复, 缺失, 倒位,重排 甲基化 基因组不稳定 基因组不稳定 多态性: SNP STR, CNV
SNPs（single nucleotide polymorphisms) single nucleotide polymorphisms)
wt/w t wt/m
m/m
DNA序列上单个碱基对的置换、插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化 插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化
突变（Gene Mutation)
单核苷酸多态（SNP）
n<0.1% n<0.1% n生殖细胞或体细胞
n150% n生殖细胞
基因芯片知名企业
基因芯片知名企业基因芯片是一种高通量的基因检测技术，可以同时检测数千个基因的表达水平、突变状态、拷贝数变化等信息。
这种技术在生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
目前，全球有许多知名的基因芯片企业，其中包括Illumina、Affymetrix、Agilent、Thermo Fisher Scientific等。
Illumina是全球最大的基因芯片企业之一，总部位于美国加利福尼亚州圣地亚哥市。
该公司成立于1998年，最初是一家生物芯片企业，后来专注于基因测序和基因芯片技术的研发和生产。
Illumina的基因芯片产品包括全基因组芯片、转录组芯片、表观基因组芯片等，广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域。
Illumina的技术优势在于高通量、高灵敏度、高精度和高可靠性，被广泛认可和应用。
Affymetrix是另一家知名的基因芯片企业，总部位于美国加利福尼亚州圣克拉拉市。
该公司成立于1992年，是全球第一家生产基因芯片的企业。
Affymetrix的基因芯片产品包括全基因组芯片、转录组芯片、SNP芯片等，应用于生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域。
Affymetrix的技术优势在于高通量、高灵敏度、高特异性和高可靠性，被广泛认可和应用。
Agilent是一家全球性的科技企业，总部位于美国加利福尼亚州圣克拉拉市。
该公司成立于1999年，最初是惠普公司的电子测量与仪器部门，后来独立成为一家科技企业。
Agilent的基因芯片产品包括全基因组芯片、转录组芯片、miRNA芯片等，应用于生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域。
Agilent的技术优势在于高通量、高灵敏度、高特异性和高可靠性，被广泛认可和应用。
Thermo Fisher Scientific是一家全球性的科技企业，总部位于美国马萨诸塞州威尔明顿市。
该公司成立于2006年，是由Thermo Electron Corporation和Fisher Scientific International合并而成。
Affymetrix生物芯片简介
Affymetrix⽣物芯⽚简介Affymetrix⽣物芯⽚解决⽅案概述Affymetrix公司作为全球销量第⼀的基因芯⽚⼚家，以其完备的芯⽚设计，稳定可靠的分析结果和强⼤的⽣物信息学分析能⼒，帮助研究⼈员在最短的时间内获得⼤量可靠的结果，为后续研究提供重要的线索和帮助。
Affymetrix公司⽬前已经在纳斯达克上市，在基因芯⽚领域中成为⾏业标准。
Affymetrix公司的巨⼤优势在于为客户提供“完整的基因芯⽚解决⽅案”，即提供全套的基因芯⽚相关产品。
包括：1. 性能优异、种类齐全的各类研究应⽤系列芯⽚产品；2. Affymetrix基因芯⽚相关试剂和试剂盒；3. 基因芯⽚杂交、洗涤、扫描检测仪器系统及相关分析软件⼯具；4. 基因芯⽚相关技术⼿册及使⽤指南等。
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该⽅法的最⼤优点在于⽤很少的步骤可合成⼤量的DNA阵列。
Affymetrix的原位合成技术可制作的点阵密度⾼达106~1010/cm2。
⾸先，使固相⽚基羟基化，并⽤光敏保护基团将其保护起来，然后选取适当的避光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。
这样，当光通过避光膜照射到⽀持物上时，受光部位的羟基就会发⽣脱保护⽽活化，从⽽可以反应结合碱基。
由于参与合成的碱基单体⼀端可以进⾏固相合成，另⼀端受光敏基团的保护，所以原位合成后，可进⾏下⼀轮的光照、脱保护和固相合成。
AFFYMETRIX基因芯片操作流程
AFFYMETRIX 基因芯片操作流程第一章真核靶片断制备＜一＞ RNA 的抽提一、 哺乳动物细胞或组织RNA 的抽提1. 总 RNA 使用 QIAGEN ' 哺乳动物组织作为+2. Poly(A) mRNA 哺乳动物细胞使用 哺乳动物组织作为 离步骤或使用kit.二、 RNA 沉淀1. 总 RNA在用RNeasy Total RNA Isolation kit 分离或洗涤后没有必要沉淀总 RNA.调整洗脱体积以制备cDNA 合成接近希望的 RNA 浓度。
注：为获得足够量的标记 cRNA 用来评估和基因芯片表达探针杂交， AFFYMETRIX 建议开 始合成cDNA 的Poly(A) +mRNA 最小浓度为0.02卩g/卩l 时的最小量是0.2卩g,总RNA 最 小浓度为0.5卩g/卩l 时的最小量是5卩g.这样有两个好处： (1) 有足够量在各步检查样品浓度和质量 (2)制备足够的cRNA 用于杂交在TRIzol 分离和热酚提取后需要乙醇沉淀；见下面方法 +2. Poly(A) mRNA大多数Poly(A) +mRNA 分离过程都会导致得到较稀浓的 RNA ，所以需要在cDNA 合成前浓缩mRNA. 3. 沉淀步骤： (1) 力口 1/10体积3M NaOAc,PH5.2,和2.5倍体积乙醇. (2) 混匀，-20C 放置最少1小时. (3) 4C ,＞ 12000x g 离心 20 分钟. (4) 80%乙醇洗涤沉淀 2次.(5) 空气干燥沉淀.继续下面步骤前检查是否干燥 . (6)DEPC 处理水重新溶解沉淀.最合适的溶解体积由cDNA 合成中需要的 RNA 的浓度和量来决定.先阅读cDNA 合成的过程来决定这一步的适合溶解体积4. RNA 测定用分光光度计分析 RNA 浓度，在260nm1单位吸光度等于 40卩g/mlRNA.需要在260和280nm 测定吸光度来确定样品的浓度和纯度 A 260/A 280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)＜二＞由纯化的总RNA 合成双链cDNAAFFYMETRIX 强烈建议 HPLC 纯化 T7-(d7) 24 primerRNeasy Total RNA Isolation kit 成功抽提哺乳动物细胞总 RNA.RNA 的来源，建议使用 TRIzol 抽提总RNA.QIAGEN ' Oligotex Direct mRNA kit,从总 RNA 中抽提 mRNA . RNA 的来源，应首先使用 TRIzol 纯化，再进行一个 Poly(A)+mRNA 分一、第一链cDNA合成开始RNA的量:高质量RNA5.0卩g -40.0卩g纯化后RNA浓缩由260nm吸光度决定（1单位吸光度=40卩g/mlRNA ）, A260/A280应接近2.0，在1.8-2.1的范围内。
全基因组扫描
遗传分析仍是当前对致病相关基因识别、鉴定的主要方法，分为连锁分析和关联研究两种。由于人类基因组多态性的研究以及SNP分型技术的发展，目前全基因组连锁分析和关联研究亦变得切实可行。根据研究规模的大小，可以将疾病遗传分析分为以下几类，即定位克隆、连锁不平衡基因定位、全基因组候选基因分析、候选基因关联研究和定位候选基因克隆，其中定位克隆、连锁不平衡基因定位和全基因组候选基因分析均属于全基因组扫描。
全基因组扫描所利用的是在人类基因组大量存在的微卫星或SNP，虽然当前使用较多的仍是微卫星，但由于芯片技术的发展，全基因组高分布密度的商品化SNP芯片相继面世(如Affymetrix公司的10k，100k和500k人基因组SNP芯片)，越来越多的研究者使用SNP进行全基因组扫描。由于这些高密度的SNP芯片价格昂贵，不是一般的实验室所能承受。
不管是单基因疾病还是多基因疾病，通常是先行全基因组扫描(genome scanning)；将疾病相关位点定位于染色体某个区域，然后再行候选基因策略或连锁不平衡分析，确定致病基因位点。如果利用家系进行连锁分析，即采用定位克隆；若是利用群体样本，则应用连锁不平衡分析进行基因定位。全基因组扫描已成功地应用在许多疾病的致病相关基因克隆上，并取得了一定的成果。
LOH检测.
LOH 检测一、 SNP 芯片Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片是由 Affymetrix 公司在2007年 5月份推出的全基因组 SNP 检测芯片,包含超过 906,600个单核苷酸多态性(SNP 检测探针以及超过 946,000个拷贝数变化(CNV 检测探针,可检测超过 180万个位点基因组序列变异, 方便研究者挖掘基因组序列变异信息。
应用领域包括:✧全基因组 SNP 分型✧全基因组 CNV 分型✧杂合性缺失(LOH 研究✧全基因组关联(GWAS 分析检测原理如下:1. 样本要求基因组 DNA :总量>1μg ; 浓度>50ng/μl; 260/280在 1.8-2.0之间, 260/230>1.8; 电泳检测无降解。
2. 检测流程(1基因组 DNA 抽提、质检与定量(2酶切与连接反应(3PCR 扩增及纯化(4片段化及标记(5样品杂交与洗脱(6图像扫描(7数据处理与分析二、 CGH 芯片Affymetrix 公司采用改进的长探针合成技术(约 49mer ,专门针对人类基因组序列变异检测推出了人类细胞遗传学全基因组 2.7M 芯片(Cytogenetics Whole-Genome 2.7M和细胞遗传学 310K 芯片(Cytogenetics 310K两种芯片产品,分别在高分辨率和低分辨率下实现对人类基因组的检测。
Affymetrix Cytogenetics Whole – Genome 2.7M芯片,是高密度的高分辨率 CGH 分析工具, 覆盖了全基因组约 270万个标记 (探针间隔距离中位值为 735bp , 其中包括约 40万个 SNP 位点。
该芯片不但可以实现拷贝数变异的高分辨率检测, 发现微小缺失和扩增,还可以检测染色体中性杂合性缺失(copy neutral LOH 、单亲二体病(UPD 及嵌合现象。
其中,以均匀分布的 SNP marker对各种类型的杂合性缺失 LOH 进行分类是 Affemetrix 拷贝数变异检测独有的特色。
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A f f y m e t r i x全基因组S N P芯片检测
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) 指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。
单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。
作为第三代遗传标记，SNP数量众多、分布密集、易于检测，因而是理想的基因分型目标。
SNP分型检测在疾病基因组（如疾病易感性），药物基因组（药效、药物代谢差异和不良反应）和群体进化等研究中具有重大意义。
在人研究方面，Affymetrix 公司有分别基于GeneChip和GeneTitan平台的SNP 6.0 芯片和针对中国人群设计的CHB1＆2 Array，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，极大地方便了中国人类疾病GWAS研究。
Affymetrix公司针对多个农业物种也开发了多款商品化的基因分型芯片，如鸡、牛、水牛、鲑鱼、水稻、小麦、辣椒、草莓等，为农业育种研究、遗传图谱构建、群体基因组学研究提供研究手段。
此外，Affymetrix公司还支持定制芯片，最低起订量为480个样品。
检测原理|?技术优势|?产品列表|?定制芯片|?数据分析|
基于GeneChip平台的人SNP 6.0 芯片实验流程：
基于GeneTitan平台的Axiom基因分型芯片检测流程：
从SNP原理谈SNP分析技术之SNP芯片
日期：2012-05-21 ? ? 来源：网络
标签：?SNP原理?SNP分析?SNP芯片
摘要:?SNP是近年来基因突变的热点研究之一。
它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。
当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。
其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。
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SNP是近年来基因突变的热点研究之一。
它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。
当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。
其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM 技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。
SNP 的分型技术可分为两个时代，一为凝胶时代，二为高通量时代。
凝胶时代的主要技术和方法包括限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、寡核苷酸连接分析(OLA)、等位基因特异聚合酶链反应分析(AS2PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)，虽然这些技术与高通量时代的技术原理大致一样，但是由于它不能进行自动化，只能进行小规模的SNP分型测试，所以必然会被淘汰。
高通量时代的SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交(ASH)、特异位点引物延伸(ASPE)、单碱基延伸(SBCE)、特异位点切割(ASC)和特异位点连接(ASL)5 种方法。
此外，采用特殊的质谱法和高效液相层析法也可以大规模、快速检出SNP 或进行SNP 的初筛。
近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成，直接合成高密度的可控序列寡核苷酸，使DNA 芯片法显示出强大威力，对SNP 的检测可以自动化、批量化，并已在建立SNP 图谱方面投入实际应用。
DNA 芯片法有望在片刻之间评价整个人类基因组。
2007 年5月份，Affymetrix?公司发布了Genome-wide SNP 6.0 芯片，除包括90多万个用于单核苷酸多态性(SNP)检测探针外，还有90多万个用于拷贝数变化(CNV)检测的探针，可使全基因组平均分辨率达3 kb，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，真正实现了一种芯片两种用途，方便研究者挖掘基因组序列变异信息。
通过基因分型信息还可以鉴别中性拷贝数的杂合性缺失(copy neutral LOH)、单亲二体病(UPD)及嵌合现象(可以精确检测到20% 嵌合体)。
近来Affymetrix 公司又陆续发布了多款针对东亚、中国、欧洲、非洲等不同人群的SNP基因分型芯片，采用GeneTitan平台进行高通量检测，极大地方便了人类疾病GWAS研究。
另外，也推出了牛、水稻等物种的基因分型芯片。
基于GENE Chip平台的人SNP 6.0 芯片实验流程：
基于GeneTitan平台的Axiom基因分型芯片检测流程：
现已发现的单核苷酸多态性在人类基因组上就已经达到了三千万以上。
SNP分析无论是对于疾病的诊治、药物的开发还是物种群体的进化都具有十分重要的意义。
问：
大夫您好，我女儿是高龄产妇，36岁，现在孕周是29周+，因为高龄所以未做唐筛，直接羊水穿刺，FLSH结果一周后出来无异常，羊水核型分析是9号染色体臂间倒位，医生建议他们夫妻做了外周血染色体检测，现在结果未出。
为保险起见，医生还建议他们用羊穿剩余的细胞液继续做SNP Array基因芯片检测，结果两周后出。
现在刚拿到结果，非常不好，9号染色体没有问题，却查出X染色体上有7.44M的片段缺失，并且包含了33个致病基因，特别是有一个CDKL5基因的缺失。
医生建议放弃这个孩子，他们很不甘心，之前的几次排畸B超都显示胎儿无任何异常。
所以，我们还想再请教一下，这样的检测结果是否100%准确？有这些致病基因的缺失是否一定会出现相应的表型？他们还需要再做什么进一步的检查吗？北京贝康医学检验所资质如何？他们如果还想怀孕需要注意什么？30周引产是不是会非常危险？
胎儿基因芯片检测结果显示X染色体上存在7.44mb的基因片段缺失，内含33个致病基因，这样的胎儿是否一定会出现致病基因提示的那些表型？B超显示胎儿无问题，我们是否必须放弃这个胎儿？我女儿这是第二胎，头胎是剖腹产，已经过了三年半，现在要30周引产，是否只能顺产不能剖腹产，危险很大吗？
答：
建议问问羊水穿刺检查实验室，胎儿如果是男胎，最好查下母亲的基因芯片分析。
如果女胎，则查夫妇双方芯片，看是否遗传。
问：
实验室告知了是女胎，认为遗传可能性不大，因为如果有这么大片段的基因缺失，我们夫妻
二人一定会有表型，但我们现在很健康，基本可以排除是遗传因素，应该是基因突变。
而且如果我们夫妻二人再做基因检查，好需要三周时间，这样胎儿月份就更大了，引产会更困难了吧？
答：
缺失这么大片段理论上会有表型，但只是理论上，最好需要验证夫妇芯片，还是建议查夫妇芯片，至少弄清这个问题。
引产在22-28周之间差别不大。
问：
谢谢何大夫，我女儿现在已经30周了，等做完夫妻芯片就该33周了，有点太迟了。
另外，如果证明是夫妻一方遗传给孩子的，那能保证孩子也会像父母一样没有表型，是健康的吗？再次感谢您的回复，我们一家人在得知检查结果后各种纠结痛苦难以名状，遗传专家的号又极为难挂，您的回复给了我们极大的帮助，不管最后结局如何，我们都对您感激不尽。
答：
如果遗传自夫妇双方之一，提示出生后理论上应该和夫妇之一表型类似，即没有多大影响，这个问题一直没得到证实，孕周一天天大，你考虑的问题可以理解，但没得到明确的答案，所以一直纠结。
应该拿到报告时就果断去检测。
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态：
已结束
病情信息：1,基因分析正常，父母核型正常，羊穿fish结果正常，羊穿核型异常，一条4号染色体为衍生染色体，短臂末端有遗传物质增加。
脐带血核型异常，嵌合体，46,xn,der（4）[3] /46,xn[42] ,异常核型细胞比例6％，正常核型细胞比例94％。
镜下分析45个细胞，核型配对15个细胞。
2，22周大排畸发现侧脑室双侧宽9mm,29周5天核磁共振左侧宽14.5右侧宽13.3，33周5天侧宽是15和17。
核磁共振除了侧宽，其他结构正常。
3，孩子可以生吗？嵌合体的异常核型对孩子有什么影响？孩子以后能正常生育的比例有多少？。