SNP检测方法汇总
生物样本的单核苷酸多态性(SNP)位点检测--高通量飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)
生物样本的单核苷酸多态性（SNP）位点检测--高通量飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）1 适用范围本标准为检验实验室进行药物靶点基因的检测提供技术指导。
本标准适用的样本包括：全血标本、石蜡包埋组织、干血片、口腔拭子、唾液等。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)，（2015年国家卫生和计划生育委员会医政医管局国卫医医护便函〔2015〕240号）个体化医学检测微阵列基因芯片技术规范（国家卫生计生委办公厅，国卫办医函〔2017〕1190号）感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南（国家卫生计生委办公厅，国卫办医函〔2017〕1190号）农业部1782号公告-12-2012 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的通知(卫办医政发〔2010〕194号)3、术语和定义3.1 rs和ss体系SNP由美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）建立、dbSNP数据库制定的SNP命名体系，rs体系的SNP代表已获得官方认可和推荐的参考SNP（reference SNP），ss体系的SNP代表用户新递交但尚未得到认可的SNP（submitted SNP）。
3.2 单核苷酸多态性（SNP）是指由单个核苷酸-A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。
3.3 等位基因（allele）一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态的一对基因。
若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说是纯合子。
SNP检测方法汇总
TaqMan SNP基因分型技术方法：此技术是由美国Life technologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。
PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。
PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。
当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。
特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。
两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。
根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型。
整个技术的示意图如下：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。
尤其适合针对全基因组SNP 关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。
RFLP (多重荧光)SNP分型技术已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。
尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。
技术方法：RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。
它是第一代DNA分子标记技术。
Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。
DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。
已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。
RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。
SNPs检测方法比较
一、定义单核苷酸多态性( single nucleotide olymorphisms ,SNPs)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。
二、SNPs的研究意义遗传标记具有已知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。
基因多态与疾病相关性研究SNPs 本身对机体的影响，尤其是疾病的易感性、个性化医疗。
三、SNPs检测方法的分类1、测序方法：常规测序，Pyrosequencing（焦磷酸测序），微测序(SNaPshot)2、基于杂交的方法：Taqman 探针法，Microarray 芯片法，3、引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC（变性高效液相色谱技术）4、以构象为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE5、溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)四、各方法概述与比较测序方法1、测序方法------ 一般测序和焦磷酸测序步骤：序列比对-- 引物设计-- DNA 提取-- PCR - 割胶纯化-- 直接测序或装克隆测序。
优点：SNP 分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。
缺点：每个样本的每个位点均需要经PCR 扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。
步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测。
2、测序方法------微测序方法（SNaPshot）微测序流程：1）.设计PCR 扩增含SNPs 位点的一段DNA2）.对PCR 产物进行纯化（去除引物和dNTP)3）.引物延伸4）.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）优势：类似普通测序，但10 个位点PCR 产物同时引物延伸，通量增加。
劣势：前处理等同普通测序：每个样品的每个位通过点都需要PCR预先扩增，跑胶，割胶，DNA 纯化。
不同是10 个位点可以同时测序，提高了测序效率，但对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6 个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。
SNP检测方法汇总
现在SNP的常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。
Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。
SNP检测方法汇总分析SNP的方法有许多种，本文收集目前还在用的方法，按通量从高到低排列：全基因组测序这是最贵的方法，但也是看SNP最全的方法大概一个人样本，花2万元外显子组测序外显子组测序，也可以得到较全面的SNP信息大概一个人样本，花1.5万元随着人全基因组测序的价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场全基因组SNP芯片原理，核酸杂交，荧光扫描Illumina和Affymetrix都有很著名的全基因组SNP芯片，例如：Affymetrix: CytoScan，SNP 6.0，Illumina: 660，中华，450K等SNP芯片，在2000~5000元每样本，还是比全基因组测序的2万元一个样本的价格要低质谱法原理，精确测量PCR产物的分子量，就可以知道SNP位点上是A/C/G/T中的哪一个Sequenome MassArray法测中等通量的SNP位点是十分准确的单个位点、单个样本的费用约2元人民币无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规的PCR引物就可以做实验了如果测几十个点，到上百个点，是很方便的方法SNPseq法此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点原理：用Goldgate法做出针对某些位点的多重PCR片段高通量测序，数据分析得到SNP位点结果SNPlex中等偏高通量的方法，一次几十个位点原理：用末端特异的引物做多重PCR，把模板进行扩增基于毛细管电泳，把片段分离开，读颜色SNaPshot中等通量的方法设计3'位挨着目标位点的探针用双脱氧的荧光标记ddNTP做一个碱基的延伸毛细管电泳，看延伸的这个碱基是什么颜色Taqman法Taqman原理，如果要找原理，请回复“荧光”两字Taqman方法，一次一管测一个位点通量最低，但是结果可靠原理：设计与SNP位点互补的荧光探针，其中一个标VIC（红色荧光基团）,另一个标FAM（绿色荧光基团），同时分别有淬来基团吸光Taq酶有5'-->3'的外切酶活性，如果探针粘有模板上，就被切碎探针被切碎后，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。
SNP检测详细步骤
SNP检测(中文)Part I：样本基因组DNA的提取1.取50 μl血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5mL，轻轻地摇匀。
冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。
重复洗2次。
2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl，15 μl的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。
3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。
4.冷冻离心机12000 rpm离心10min。
5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。
6.用等体积的氯仿再抽提一次。
7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60min。
8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。
9.加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。
冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。
10.沉淀于100 μl超纯水中。
11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。
Part II：SNP分型检测1.引物的设计与合成(1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成；(2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成2.PCR扩增片段(1)PCR扩增体系：Components Volume (μl)DNA template1PrimeSTAR0.5dNTPs (2.5 mM)1Primer-F (10 μM)1Primer-R (10 μM)15*PS buffer(Mg2+)10ddH2O1(2)PCR扩增程序：(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。
SNP分析原理方法及其应用
SNP分析原理方法及其应用SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）是指在基因组中的一些位置上，不同个体之间存在的碱基差异，是常见的遗传变异形式之一、SNP分析是研究SNP在基因与表型之间关联性的方法，用于揭示SNP与遗传疾病、药物反应性等的关系。
本文将介绍SNP分析的原理、方法以及其应用。
一、SNP分析原理1.SNP检测技术：SNP检测技术包括基于DNA芯片的方法、测序技术、实时荧光PCR等。
其中，高通量测序技术是最常用的SNP检测方法，可以同时检测数千个SNP位点。
2.数据分析与统计学方法：通过SNP检测技术获得的数据可以分为基因型数据（AA、AB、BB等）和等位基因频率数据（A频率、B频率等）。
统计学方法常用的有卡方检验、线性回归、逻辑回归等，用于研究SNP与表型之间的关联性。
二、SNP分析方法1.关联分析：关联分析是研究SNP与表型之间关联性的基本方法。
常用的关联分析方法包括单基因型分析、单SNP分析、基因组关联分析（GWAS）等。
单基因型分析主要是比较单个SNP的基因型在表型不同组之间的差异；单SNP分析是研究单个SNP是否与表型相关；GWAS是通过分析数万个SNP与表型之间的关系来找到与表型相关的SNP。
2. 基因型预测：基因型预测是根据已有的SNP数据，通过统计模型来预测个体的基因型。
常用的基因型预测方法有HapMap、PLINK等。
3. 功能注释：功能注释是研究SNP位点的生物学功能，揭示SNP与基因功能、表达水平之间的关系。
常用的功能注释工具有Ensembl、RegulomeDB等。
三、SNP分析应用1.遗传疾病研究：SNP与遗传疾病之间存在着密切的关系。
通过SNP分析可以发现与遗传疾病相关的SNP位点，进一步揭示疾病发生的机制，为疾病的诊断、治疗提供依据。
2.药物反应性研究：个体对药物的反应性往往存在较大差异，这与个体的遗传背景密切相关。
SNP单核苷酸多态性检测技术
1定义：单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism，SNP），主若是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所惹起的 DNA 序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最常有的一种。
占全部已知多态性的 90%以上。
SNP 在人类基因组中宽泛存在，平均每 500～1000 个碱基对中就有1 个，预计其总数可达 300 万个甚至更多。
SNP 所表现的多态性只波及到单个碱基的变异，这类变异可由单个碱基的变换（transition）或颠换（transversion）所惹起，也可由碱基的插入或缺失所致。
但平时所说的 SNP 其实不包括后两种情况。
单核苷酸多态性（ SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。
所谓变换是指同型碱基之间的变换 ,如嘌呤与嘌呤 ( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的取代 ;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶 (A2T 、A2C 、C2G、G2T) 之间的取代。
从理论上来看每一个 SNP 位点都能够有 4 种不同的变异形式，但实质上发生的只有两种，即变换和颠换，两者之比为 2：1。
SNP 在 CG 序列上出现最为频频，而且多是C 变换为 T ，原因是 CG 中的 C 常为甲基化的，自觉地脱氨后即成为胸腺嘧啶。
一般而言， SNP 是指变异频率大于 1 %的单核苷酸变异。
在人类基因组中大体每 1000 个碱基就有一个 SNP ，人类基因组上的 SNP 总量大体是 3 ×106个。
依照排列组合原理 ,SNP 一共能够有 6 种取代情况,即 A/ G、 A/ T 、A/ C 、C/ G、C/ T 和 G/ T ,但事实上 ,变换的发生频率占多数 ,而且是 C2T 变换为主 ,其原因是 Cp G 的 C 是甲基化的 ,简单自觉脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也所以变为突变热点。
理论上讲，SNP 既可能是二等位多态性，也可能是3 个或4 个等位多态性，但实质上，后两者特别少见，几乎能够忽略。
snp鉴定流程
SNP（单核苷酸多态性）鉴定是研究基因变异和关联分析的重要方法。
SNP鉴定流程主要包括以下几个步骤：
1. 样本收集与DNA提取：从生物体（如血液、组织、细胞等）中提取DNA。
2. 基因组DNA定量：使用spectrophotometer（分光光度计）或其他相关设备，对提取的DNA进行定量，确保实验过程中的DNA浓度一致。
3. 基因组DNA酶切：根据实验需求，选择合适的酶切酶，对DNA进行酶切。
酶切后的DNA片段长度分布均匀，便于后续实验操作。
4. 连接酶切片段与荧光标记的适配子：将酶切后的DNA片段与荧光标记的适配子连接，形成复合物。
该步骤为后续杂交和检测打下基础。
5. 杂交与洗涤：将制备好的复合物在特定设备（如杂交箱）中进行杂交，然后洗涤去除未结合的荧光标记适配子。
6. 荧光检测与数据分析：将洗涤后的样本置于荧光检测设备中，检测荧光信号。
根据荧光信号的强弱，分析样本中的SNP位点。
7. 结果验证与分析：对检测结果进行验证，如PCR扩增、测序等。
进一步分析SNP位点的分布、频率等，探讨其与疾病、表型等因素之间的关系。
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现在SNP的常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。
Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。
SNP检测方法汇总
分析SNP的方法有许多种，本文收集目前还在用的方法，按通量从高到低排列：
全基因组测序
这是最贵的方法，但也是看SNP最全的方法
大概一个人样本，花2万元
外显子组测序
外显子组测序，也可以得到较全面的SNP信息
大概一个人样本，花1.5万元
随着人全基因组测序的价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场
全基因组SNP芯片
原理，核酸杂交，荧光扫描
Illumina和Affymetrix都有很著名的全基因组SNP芯片，例如：
Affymetrix: CytoScan，SNP 6.0，
Illumina: 660，中华，450K等
SNP芯片，在2000~5000元每样本，还是比全基因组测序的2万元一个样本的价格要低质谱法
原理，精确测量PCR产物的分子量，就可以知道SNP位点上是A/C/G/T中的哪一个Sequenome MassArray法测中等通量的SNP位点是十分准确的
单个位点、单个样本的费用约2元人民币
无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规的PCR引物就可以做实验了
如果测几十个点，到上百个点，是很方便的方法
SNPseq法
此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点
原理：
用Goldgate法做出针对某些位点的多重PCR片段
高通量测序，数据分析得到SNP位点结果SNPlex
中等偏高通量的方法，一次几十个位点
原理：
用末端特异的引物做多重PCR，把模板进行扩增基于毛细管电泳，把片段分离开，读颜色SNaPshot
中等通量的方法
设计3'位挨着目标位点的探针
用双脱氧的荧光标记ddNTP做一个碱基的延伸毛细管电泳，看延伸的这个碱基是什么颜色Taqman法
Taqman原理，如果要找原理，请回复“荧光”两字Taqman方法，一次一管测一个位点
通量最低，但是结果可靠
原理：
设计与SNP位点互补的荧光探针，其中一个标VIC（红色荧光基团）,另一个标FAM（绿色荧光基团），同时分别有淬来基团吸光
Taq酶有5'-->3'的外切酶活性，如果探针粘有模板上，就被切碎
探针被切碎后，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。
看荧光颜色，就可以知道SNP位点上是什么碱基
ArrayTape法
基于Taqman原理
用塑料卷代替微孔板，用水浴锅代替PCR仪，提供通量
费用降到0.7元/SNP/样本以下
OpenArray法
OpenArray法，基于Taqman原理
用预置了PCR引物的微孔来代替微孔板
费用可降到1元人民币/SNP/样本。