SNP检测方法共34页文档
生物样本的单核苷酸多态性(SNP)位点检测--高通量飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)
生物样本的单核苷酸多态性（SNP）位点检测--高通量飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）1 适用范围本标准为检验实验室进行药物靶点基因的检测提供技术指导。
本标准适用的样本包括：全血标本、石蜡包埋组织、干血片、口腔拭子、唾液等。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)，（2015年国家卫生和计划生育委员会医政医管局国卫医医护便函〔2015〕240号）个体化医学检测微阵列基因芯片技术规范（国家卫生计生委办公厅，国卫办医函〔2017〕1190号）感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南（国家卫生计生委办公厅，国卫办医函〔2017〕1190号）农业部1782号公告-12-2012 转基因生物及其产品食用安全检测蛋白质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的通知(卫办医政发〔2010〕194号)3、术语和定义3.1 rs和ss体系SNP由美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）建立、dbSNP数据库制定的SNP命名体系，rs体系的SNP代表已获得官方认可和推荐的参考SNP（reference SNP），ss体系的SNP代表用户新递交但尚未得到认可的SNP（submitted SNP）。
3.2 单核苷酸多态性（SNP）是指由单个核苷酸-A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。
3.3 等位基因（allele）一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态的一对基因。
若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说是纯合子。
SNP检测方法汇总
TaqMan SNP基因分型技术方法：此技术是由美国Life technologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。
PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。
PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。
当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。
特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。
两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。
根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型。
整个技术的示意图如下：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。
尤其适合针对全基因组SNP 关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。
RFLP (多重荧光)SNP分型技术已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。
尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。
技术方法：RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。
它是第一代DNA分子标记技术。
Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。
DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。
已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。
RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。
SNP检测
SNP(single nucleotide polymophism) ，即单核苷酸多态，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。
一般来说，一个SNP 位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。
SNP研究包括SNP发现（discovery）、SNP验证（validation）以及SNP筛选（Screening or Scoring）。
广泛用于群体遗传学研究（如生物的起源、进化及迁移等方面，将逐渐取代微卫星而成为新一代的分子生物学标记），和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。
1.直接测序法在所有SNP的检测方法中，对待检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法，也是SNP 分析的金标准。
通过直接测序方法进行SNP检测的检出率接近100%。
服务内容（1）样品基因组DNA提取（2）根据不同的区域进行引物设计、合成（3）对所有样品进行基因扩增并纯化（4）测序（5）统计与分析客户提供血液样品：样品为EDTA抗凝或柠檬酸钠抗凝，样品量大于1ml，样品采集后于-20℃或-80℃保存；组织样品：样品可以为新鲜组织（最好-80℃保存）、石蜡包埋组织或95%乙醇中固定的组织，组织量大于50µg 细胞、菌液等。
我们提供详细的实验流程；电泳图；测序谱图；SNP基因型统计结果。
2.Taqman探针法（定量PCR）客户根据实验要求挑选出SNPs后，提交给我们进行引物与探针设计与合成，通过进行基因组DNA抽提，并进行定量PCR检测，帮您轻松完成大量样品的检测与分析。
技术特点适合位点数量少，样本通量高的检测；应用定量PCR仪进行定量检测；操作简便，只需一步PCR 反应，无须进行纯化和预处理，直接上机检测；结果清晰，软件分析结果界面友好，标出了每个样本的基因型及荧光强度，非常直观。
服务内容引物及探针的设计及合成；样品DNA抽提；PCR方案的制定；上机检测，数据采集与分析客户提供血液样品：样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝，样品量大于1ml，样品采集后于-20℃或-80℃保存；组织样品：样品可以为新鲜组织（最好-80℃保存）、石蜡包埋组织或95%乙醇中固定的组织，组织量大于50µg 细胞、菌液等。
SNP及检测技术
1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最常见的一种。
占所有已知多态性的90%以上。
SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。
但通常所说的SNP并不包括后两种情况。
单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。
所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。
从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。
SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。
一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。
在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。
依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。
理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。
因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。
这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。
SNP检测技术
PCR-RFLP方法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性， 用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片 断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位 点。
特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该 限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的 方法之一.
直接测序是最容易实施的SNP检测方法。 原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测 序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检 出率可达100%。
特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分 型所需要的重要参数。
基因芯片技术( Genechips)
原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的 载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好 的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出 待测序列的碱基类别。
等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特 异链)的3′末端与 SNP位点的碱基互补(或相同) , 另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,ASPCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引 物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没 有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增 产物的有无,从而确定基因型的 SNP。
电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分 子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到 达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始 分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电 场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。 由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其 变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条 带。
变性高效液相色谱( DHPLC)
SNP及检测技术
1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最常见的一种。
占所有已知多态性的90%以上。
SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。
但通常所说的SNP并不包括后两种情况。
单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。
所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。
从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。
SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。
一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。
在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。
依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。
理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。
因此，通常所说的SNP 都是二等位多态性的。
这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。
SNP检测方法(讲课版)2
3.以构象为基础的方法
单链构象多态性( single strand conformational polymorphism ,SSCP) 温度梯度凝胶电泳( temperature gradient gel electrophoresis ,TGGE) 变性梯度凝胶电泳( denaturing gradient ge electrophoresis ,DGGE) 变性高效液相色谱检测 ( denaturing high performance liquid chromatography ，DHPLC)
CCR(combined chain reaction )
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基本步骤
1、DNA模板的变性 2、引物和单链模板间的退火 3、DNA聚合酶(无5′- 3′外切酶活性) 催 化引物延伸 4、延伸引物的3′端和下游引物5′端间 的连接。
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优点：
1.快速简单，仅需DNA 的分离、CCR 扩增、 琼脂糖凝胶电泳检测产物几步 2. 产生的产物片段大, 通过琼脂糖凝胶电泳 就可实现对产物的检测（不需引物标记 等繁琐技术）
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基本原理和步骤
1.质谱分析在样品分子离子化后,根据不同离子间 的质荷比的差异来分离并确定分子量，很容易 将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开。 2.样品来源可以是PCR 产物、引物延伸反应、入 侵者酶切产物等,通过质谱可直接检测样品或探 针的不同质量,推导出样品的SNPs. 3.利用质谱分析一个样品只需几秒钟, 具有快速、 准确、自动化程度高和高通量等特点. 5.主要的问题是需对分析样品进行纯化后才能检 测。
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LRCA (ligation-rolling circle amplication）
SNP检测详细步骤
SNP检测(中文)Part I：样本基因组DNA的提取1.取50 μl血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5mL，轻轻地摇匀。
冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。
重复洗2次。
2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl，15 μl的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。
3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。
4.冷冻离心机12000 rpm离心10min。
5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。
6.用等体积的氯仿再抽提一次。
7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60min。
8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。
9.加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。
冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。
10.沉淀于100 μl超纯水中。
11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。
Part II：SNP分型检测1.引物的设计与合成(1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成；(2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成2.PCR扩增片段(1)PCR扩增体系：Components Volume (μl)DNA template1PrimeSTAR0.5dNTPs (2.5 mM)1Primer-F (10 μM)1Primer-R (10 μM)15*PS buffer(Mg2+)10ddH2O1(2)PCR扩增程序：(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。
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2.基于酶的方法
1）DNA聚合酶 2）连接酶 3）限制性内切酶 4）外切酶FEN 5）RNase H
DNA聚合酶法
❖ Taqman法 ❖ 单碱基延伸法 ❖ 焦磷酸测序法
此类方法是根据PCR 过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对SNP位点的检测, 是基于以下两点: (1) 错配出现在引物中部时致使稳定性降低,在严格杂交条件下将不能退火; (2) 错配出现在引物3′端时,引物将不能延伸。
1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.电泳法 4.直接测序法
另外还包括化学法（如高锰酸钾法），物理法（例 如基质辅助的激光吸附／离子化飞行时间质谱分析） 等。
1.基于杂交的方法
❖ 原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时， 在完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体 稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。（Tm差异越 大，检测的特异性就越好）
➢ 其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP (synonymous cSNP)和非同义cSNP (non-synonymous cSNP)。
SNP的主要特征
❖ （一）、密度高。SNPs 在人类基因组中的总数超过 300万。
❖ （二）、遗传稳定性好。 ❖ （三）、分布不均匀。非编码区的数目远远大于编
❖ 一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此 又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较 高，大约平均每1分类
➢ 根据在基因中的位置，SNP 可分为基因编码区SNP(coding SNP, cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatory SNP, rSNP)。
码区的数目。 ❖ （四）、具有代表性。 ❖ （五）、分析易自动化。由于每个SNP 位点通常仅
含两个等位基因——双等位基因(biallele)，在检 测时能通过一个简单的“+/−”分析进行基因型分 型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。
SNP检测技术
理想的检测SNPs的方法
——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs
单碱基延伸法（single base extension)
基本步骤
1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA。 2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)。 3.引物延伸。 4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光
检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分 析法、变性高压液相色谱法等）。
焦磷酸测序法 (Pyrosequencing )
核酸肽探针 （Peptide nucleic acids，PNA)
❖ 其骨架是肽键
❖ 特点：
1、与靶分子高特异性地结合 （3个方面的影响）；
2、链挤入 （形成三链复合结 构）（表达调控以及反义治 疗方面）；
3、对核酸酶和蛋白酶均不敏 感（体外应用）。
与靶分子高特异性地结合
❖ Tm值高 ❖ 受盐浓度影响小（低盐浓度的体系） ❖ △Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降
主要内容
❖ 一、SNP概念、分类与特点 ❖ 二、SNP检测技术 ❖ 三、SNP研究现状 ❖ 四、SNP应用前景
SNP概念
❖ SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸 多态性，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸 改变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺 失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占 80%。
因此针对不同等位基因设计平行引物,上游引物的3′端和多态性位点互补, 这样只有和引物完全互补的序列才能得到扩增,不同的等位基因依赖于所使 用的不同引物分别得以扩增。产生的PCR 产物可以通过凝胶电泳或实时 的荧光测定来实现对其的分析。
Taqman 法
优点：闭管进行， 减少污染。
缺点：淬灭难以彻底， 本底较高。
❖ 原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行 引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦 磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能 引一种化学发光反应,通过发光计的实时监 测来达到检测的目的。
基本步骤
1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与 酶和底物孵育。
2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入 反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键， dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。
3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的 峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
❖ 必须具备以下优点: (1) 适合自动化操作,简便、迅速; (2) 分析费用低,特殊试剂用量少; (3) 反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果; (4) 数据分析简单,易于自动化分析; (5) 反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的
检测与分析。
现在常用的SNP检测技术：
DASH
(dynamic allele-specific hybridization）
（2）杂交+荧光探针
分子信标（双分子间杂交）
分子信标（Molecular beacons）
分子信标是一种 新型的发夹结构 的寡核苷酸探针
是在样品PCR 过程中因和样品 DNA 杂交后而使 自身荧光构象改 变从而实现SNP 的检测。
低8-20度） 所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排 除。
LNA(locked nucleic acids)
❖ 其结构是在RNA分子的2′羟 基和核糖环的4′碳原子间 连入一个亚甲基的“桥”。
❖ 特点： 1.能以很高的亲和性和互补
的DNA、RNA 或LNA 结合 （构象更利于杂交的稳定） 2.匹配和不匹配之间的△Tm 增加
❖ 分为： (1）利用△Tm； (2）杂交+荧光探针。
(1)利用△Tm
❖ 固定温度 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等
❖ 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 (dynamic allelespecific hybridization, DASH)