第二章 DNA的复制

1、DNA聚合酶
指以DNA为模板，dNTP为底物催化DNA合成的一类酶。 原核和真核细胞中均普遍存在。
作用特点：
1.需dNTP，Mg2+,DNA模板 2.只能以5’--3’方向延长链，不能发动新链 3.需有一个游离3’-OH的引物
1956年A.Kornberg等首首先在大肠杆菌中发现， DNA聚合酶，其后在不同生物中均发现该酶。
5′
实验验证
三、复制的几种主要方式
生物体内DNA分子的存在形式各不相同，功能状态 也各不相同，因此，反映在复制方式上就由所差别。 线性DNA双链的复制 环状DNA双链的复制
θ型 滚环型 D-环型
1.线性DNA双链的复制
5’端的DNA链复制需要有特殊的安排
wRNA引物被切除后，留下5’部分单链DNA不 能为DNA聚合酶作用
⑴DNA-pol Ⅰ（109kD）
N端 木瓜蛋白酶 小片段 323个氨基酸 5′ → 3′核酸外切酶活性 大片段/Klenow 片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 3′ → 5′ 核酸外切酶活性 • Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学 研究中常用的工具酶。 C端
• 核酸外切酶活性
DNA聚合酶I
Arthur Kornberg 1918 Stanford University Stanford, CA, USA
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959
"for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid"
Meselson-Stahl同位素示踪实验
细菌 （含 15 N-DNA 特殊培养基） 普通培养基 （含 14 N-DNA） 子一代 普通培养基 （含 14 N-DNA） 子二代
1958年，米西尔逊-斯塔尔首次用14N和15N标记的大肠 杆菌同位素示踪结合DNA密度梯度离心实验直接证明 了DNA的半保留复制。
第三节 DNA的复制
一、 DNA复制的概况 二、 DNA复制的基本概念 三、 复制的几种主要方式 四、 原核生物DNA复制的特点 五、 真核生物DNA复制的特点 六、 DNA复制的调控 七、 DNA的修复 八、 DNA的转座
一、DNA复制的概况
复制：是指遗传物质的传代，以母链DNA为模
相向复制 双向复制
单向复制
E.coli复制终止点
细菌复制终止区含有多个约20bp的终止子位点 （Ter）。E.coli有7个终止子位点。
3′
复制的半不连续性：
前导链
5´
5′ 3′
3´
解链方向
后随链
3 ´ 3´
5´
顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链。
另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股 前导链连续复制而后随链不连续复制，就是复制的半不连续性。 不连续复制的链称为后随链。复制中的不连续片段称为冈崎片段。
2.环状DNA双链的复制
• 滚环型
单向复制的特殊方式 滚环产生原始序列的单 链多聚物 DNA的合成由对正链原点 的专一性切割开始，所形成 的自由5’端被从双链环中置 换出来并为单链DNA结合 蛋白所覆盖，使其3’-OH端 在DNA聚合酶作用下不断 延伸。
• D-环型
首先在动物线粒体DNA的 复制中发现 单向复制的一种特殊方式 双链环在固定点解开进行 复制。 两条链的合成都需要先合 成RNA引物，都不形成冈 崎片段，因此都是连续合 成。 两条子链的合成在时间上 是不同步的。
引物酶
DnaA蛋白
单 链 结 合 蛋 白
解链酶
拓扑异构酶I
DNA复制的引发
图2-24 由大肠杆菌oriC复制起始点 处引发的DNA复制过程
1、拓扑异构酶解开超螺旋。 2、Dna A蛋白识别并在ATP存在 下结合于四个9bp的重复序列。 3、在类组蛋白（HU、ATP参与下, Dan A蛋白变性13个bp的重复序 列,形成开链复合物。 4 、Dna B借助于水解ATP产生的 能量在Dna C的帮助下沿5’ →3’ 方向移动，解开DNA双链，形成 前引发复合物。 5、单链结合蛋白结合于单链。 6、引物合成酶（Dna G蛋白）开 始合成RNA引物。
位于ori的左侧，有利于双链解链 w 含有11个GATC序列——甲基化则起始点活化
复制起始点的研究
复制的方向： 多数为双向复制，少数为单向复制 多数双向对称复制，少数双向不对称复制 复制眼--在复制原点处将双螺旋解开成单链 状态，形成一个眼状结构。 复制叉--DNA复制进行时，在眼的两侧出现的 两个叉子状的生长点。
按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列 一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保 守性。
遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。
生物化学教研室
二、DNA复制的基本概念
大肠杆菌染色质 DNA复制的放射 性自显影照片
复制子—是染色体独立完成复制的功能单位。
复制子含有控制复制起始的特定位点（复制起始点），以及 控制复制终止的位点（复制终止点）。 原核生物一般只有一个复制起点，因此只有一个复制子。 真核生物习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。 DNA具有多个复制原点，因此有多个复制子。
E.coli复制延伸
冈崎片段与半不连续复制
3′
5´
前导链 5′ 3′
3´
解链方向
3´
5´
后随链
3´
5′
冈崎片段的连接
切除引物：由DNA聚 合酶I催化 填补空隙：由DNA聚 合酶I催化 连接缺口：由DNA连 接酶催化
DNA复制示意图
5/ 3/
拓扑异构酶 解链酶 单链结合蛋白 引物酶
DNA聚合酶Ⅲ 冈崎片段 DNA聚合酶Ⅰ DNA连接酶
原核生物的DNA聚合酶
1956年A.Kornberg在大肠杆菌中发现 DNA聚合酶I: 校读错误，填补空隙，切除引物
DNA聚合酶II: 在无polI及pol III的情况下才起作 用，其真正的功能也未完全清楚。 DNA聚合酶III:主要的合成酶，多种亚基组成的聚合 体，作用同酶I DNA聚合酶IV、DNA聚合酶V于1999年发现，参与 DNA的错误倾向修复(SOS修复)。
¾引物酶与多种起始蛋白结合形成引发体 ¾引物酶催化合成引物（primer)
4、DNA连接酶
基因工程重要的工具酶
在DNA修复、重 组、剪接中缝合 缺口 但：不连接单独 存在的DNA或RNA 单链
（二）原核生物DNA的复制过程
1.复制的起始 2.复制的延伸 3.复制的终止
E.coli复制起始
参与复制起始的各种蛋白质 名称
•θ型
复制起始点涉及DNA双链的解旋和松开，形成两个方向相反的复制 叉。前导链DNA开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短 RNA链，作为起始DNA复制的引物
四、 原核生物DNA复制的特点
（一）参与DNA生物合成的物质
1. DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 2. 拓扑异构酶 (topoisomerase) 3. 解链酶(解螺旋酶) (DNA helicase) 4. 单链结合蛋白 (single-strand binding protein,SSB) 5. 引物酶(primase)与引发体(primosome) 6. DNA连接酶 (DNA ligase)
复制子
复制起点（复制原点）—DNA复制的特定起始位点。常用ori(或o） 表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。 原核生物单点起始，真核生物多点起始。
复制起点oriC
4X106bp
E. Coli 基因图
E.coli复制起始点 oriC结构特点:
1
13
17
29
32
44
GATCTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ···
5´
AG C T T C A G G A T A
→
3´
| | | | | | | | | | |
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
• 3′ → 5′外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 • 5′ → 3′外切酶活性 能切除突变的 DNA片段。
错配碱基
切除错配 核苷酸
子代DNA-子代DNA 母链DNA
验证半保留复制的实验
一、Meselson-Stahl实验 二、Taylor实验 三、姐妹染色单体差别染色方法 5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，简称 BUdR），斑色染色体（Harlequin chromosome） 四、Cairns复制模型—θ型复制
聚合酶
正 确核 苷酸
复制方向
3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´
DNA聚合酶的校对功能
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
⑵DNA-pol Ⅱ（120kD）
• 没有5′ → 3′核酸外切酶活性，活性低 • DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 • 目前认为它参与DNA损伤的应急状态修复。 • 具体功能仍不清楚
⑶DNA-pol Ⅲ (250kD)
Taylor蚕豆根尖放射性自显影实验：
姐妹染色单体差别染色方法
Cairns复制模型—θ型复制
z 半保留复制的定义:
以DNA分子中的每一条链为模板，通过碱基互补配对原则， 合成两个新的子代DNA分子，每个新DNA分子的两条链中，一 条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。