大型真菌分子遗传连锁图谱研究进展
真菌基因组学研究进展
真菌基因组学研究进展真菌为低等真核生物，种类庞大而多样。
据估计，全世界约有真菌150万种，已被描述的约8万种。
真菌在自然界分布广泛，存在于土壤、水、空气和生物体内外，与人类生产和生活有着非常密切的关系。
许多真菌在自然界的碳素和氮素循环中起主要作用，参与淀粉、纤维素、木质素等有机含碳化合物及蛋白质等含氮化合物的分解。
有些真菌如蘑菇、草菇、木耳、麦角、虫草、茯苓等可直接供作食用和药用，或在发酵工业、食品加工业、抗生素生产中具有重要作用。
然而，也有些种类引起许多植物特别是重要农作物的病害，如水稻稻瘟病、小麦锈病、玉米腥黑穗病、果树病害等。
少数真菌甚至是人类和动物的致病菌，如白色假丝酵母Candida albicans等。
因此，合理利用有益真菌，控制和预防有害真菌具有重要意义。
本文整理了已完成基因组序列测定的真菌的信息，并对真菌染色体组的历史、测序策略及其基因组学的研究进展进行了评述。
1真菌染色体组的研究历史和资源1986年美国科学家Thomas Rodefick提出基因组学概念，人类基因组计划带动了模式生物和其它重要生物体基因组学研究。
阐明各种生物基因组DNA中碱基对的序列信息及破译相关遗传信息的基因组学已经成为与生物学和医学研究不可分割的学科。
由欧洲、美国、加拿大和日本等近百个实验室六百多位科学家通力合作，1996年完成第一个真核生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组测序，这对于酵母菌类群来说是一个革命性的里程碑，并且激起了真核基因功能和表达的第一次全球性研究(Goffeau etal，1996)。
随后粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(Wood etal.2002)和粗糙脉孢霉Neurospora crassa(Galagan etal.2003)染色体组的完成显露出酿酒酵母作为真菌模式生物的局限性。
尽管如此，真菌染色体组测序的进展最初是缓慢的。
食用菌分子生物学研究进展_黄小丹
仲恺农业工程学院学报,22(3):53～58,2009J o u r n a l o f Z h o n g k a i U n i v e r s i t yo f A g r i c u l t u r e a n d E n g i n e e r i n g文章编号:1674-5663(2009)03-0053-06收稿日期:2009-04-28基金项目:广东省科技计划(2007A 02032-5)、广州市海珠区科技计划(2007-Z -018)资助项目.作者简介:黄小丹(1960-),女,辽宁营口人,高级实验师. ＊通讯作者:E -m a i l :l i u j l 1963@126.c o m食用菌分子生物学研究进展黄小丹,柳建良＊(仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州510225)摘要:对食用菌分子生物学研究进展进行了综述,内容包括食用菌遗传转化所用的筛选标记、启动子、转化方法和存在问题,以及D N A 分子标记技术在食用菌菌种和菌株鉴定、遗传多样性分析、基因定位和克隆研究中的应用.关键词:食用菌;转基因;分子标记;分子生物学中图分类号:S 646 文献标识码:AP r o g r e s s i nm o l e c u l a r b i o l o g y o f e d i b l e f u n g iH U A N GX i a o -d a n ,L I UJ i a n -l i a n g＊(L i g h t I i n d u s t r y a n dF o o d C o l l e g e ,Z h o n g k a i U n i v e r s i t y o f A g r i c u l t u r e a n d E n g e e r i n g ,G u a n g z h o u 510220,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p r o g r e s s i n m o l e c u l a r b i o l o g y o f e d i b l e f u n g i w a s s u m m a r i z e d ,i n c l u d i n g s c r e e n i n g m a k -e r s ,p r o m o t e r s ,a n d t r a n s g e n i c m e t h o d s a n d p r o b l e m s i n e d i b l ef u ng i t r a n s f o r m a t i o n ;a n d th e a p p li c a t i o no f D N Am o l e c u l a r m a r k e r s i n v a r i e t y a n d s t r a i n i d e n t i f i c a t i o n ,g e n e t i c d i v e r s i t y ,a n d g e n e m a p p i n g a n dc l o n i n g o f ed i b lef u ng i .K e y w o r d s :e d i b l e f u n g i ;t r a n s g e n i c ;m o l e c u l a r m a r k e r ;m o l e c u l a r b i o l o g y 生命科学因现代分子生物学的不断发展而逐渐成为21世纪科技革命的主流.相对于动植物而言,食用菌分子生物学研究工作起步较晚,同时由于市场的狭小和缺少对食用菌研究的大量投资,导致食用菌分子生物学研究滞后.但鉴于食用菌生活周期短、基因组小、实验操作技术简便等特点,从而吸引了遗传育种学家注意力,这就是近年来食用菌遗传育种研究,特别是分子生物学方面发展较快的主要原因.由于食用菌具有特殊的香味,且具有低热量、低脂肪的营养特点和降血压、抗肿瘤及增强机体免疫力的功效,因此愈来愈受到广大消费者的喜爱[1-2].传统的遗传育种方法周期长、见效慢,现代分子生物技术为高产、优质、抗逆、强适应性菌株的筛选提供了一种更为高效快捷的物种改造方式,作者对食用菌分子生物学研究进展进行综述,希望能够供相关研究与应用参考.1 食用菌转基因研究最早报道的食用菌转化是C h a l l e n 等[3]利用聚乙二醇(P E G )法把外源D N A 导入双孢蘑菇(A g a r i c u sb i s p o r u s I m b ac h )的原生质体中,获得转化子.随后一些学者[4]又相继报道了几例食用菌如平菇(P l e u r o -t u s o s t r e a t u s Q u e l .)、草菇(V o l v a r i e l l a v o l v a c e a S i n g .)、杨树菇(A g r o c y b e a e g e r i t a S i n g .)和香菇(L e n t i n u s e d o d e s )的遗传转化取得成功.1.1 常用筛选标记目前食用菌常用的筛选标记主要有营养缺陷型标记、抗生素抗性标记和代谢物抗性标记3种类型.54仲恺农业工程学院学报第22卷1.1.1 营养缺陷型标记 该标记基因来自宿主本身,属于同源转化,易引导载体在染色体的同源部位整合和基因表达.目前已有营养缺陷型标记基因U r a1(二氢乳清酸)、P a b1(p-氨基苯甲酸)、T r p2(色氨酸)等基因成功应用于杨树菇、灰盖鬼伞(C o p r i n u s c i n e r e u s S.F.G r a y)、双孢蘑菇的遗传转化的报道[4,8-9].基于同源转化的高转化率和高安全性,营养缺陷型标记都是一种优良的选择标记,但食用菌营养缺陷型菌株不易获得,因而限制了这种筛选标记的应用.1.1.2 抗生素筛选标记 在食用菌转化研究中使用过的抗性标记基因有潮霉素抗性基因(H y g r或H p t)、腐草霉素抗性基因(P h l r)、博来霉素抗性基因(B l e r)等.其中应用最多的是潮霉素抗性基因H y g r,现已经在平菇、香菇、双孢蘑菇中获得表达,并以在香菇的转化中效果较好[7,10-11].1.1.3 代谢物抗性标记 T r p3的突变基因T r p3i a r来源于灰盖鬼伞中分离出的5-F I抗性菌株,是第一个分离自担子菌的阳性标记基因,可以导致对代谢物5-氟基吲哚(5-f l u o r o i n d o l e,5-F I)的抗性;将T r p3i a r 作为筛选标记用于平菇和草菇的转化,得到了5-F I抗性转化子[5,12].这个标记基因属于近同源基因转化,不易甲基化,易于表达,适于在食用菌遗传转化上应用.1.2 常用启动子目前在食用菌转化领域,对启动子的研究主要集中在强启动子和同源启动子方面,因为不同的启动子会影响食用菌转化效率和外源基因表达.目前常用的启动子主要有R A S基因启动子和G P D基因启动子[5,12].1.3 常用方法食用菌遗传转化方法多借鉴成功的动物、植物、微生物转化方法,目前主要有以下几种:1.3.1 聚乙二醇法(P E G) P E G法对原生质体的损伤相对较小,而且方法简便,是食用菌遗传转化中应用最多的一种方法,已在双孢蘑菇、平菇、草菇等食用菌中成功应用[4-5].王春晖等[13]曾采用P E G法将平菇D N A导入草菇原生质体,选育出菇型、酶活力及生物转化率与亲本有显著差异的V157-1菌株.但该方法转化率较低,通常为10-5～10-6.1.3.2 电激法 C h a l l e n等[3]首先应用此法把U R A1转入同源的杨树菇营养缺陷型菌株中获得转化子,尔后用于双孢蘑菇和平菇的转化[4,10].贾建航等[14-15]采用该技术将香菇D N A、糙皮侧耳(P l e u r o t u s o s t r e a-t u s)D N A分别导入平菇、紫孢侧耳(P l e u r o t u s s a p i d u s)原生质体中,并得到了转化子.与P E G法相比,电激法可电激原生质体、菌丝体或完整细胞,操作更为简便,需要的D N A也较少,但对转化体的损伤较大,转化率也比较低.1.3.3 限制性酶介导整合法 (R e s t r i c t i o n e n z y m e-m e d i a t e d i n t e g r a t i o n,R E M I)S c h i e s t l等[16]于1991年首次利用该法在酿酒酵母转化上获得成功,随后相继在盘基网柄菌(D i s t y o s t e l i u m d i s c o i d e u m)、担子菌灰盖鬼伞、香菇等转化上取得成功[7,17-18].R E M I法由于限制性内切酶的定位作用可大幅度地提高整合率,进而大幅度提高转化率,但酶的种类与浓度会影响转化率,且易引起突变而产生假阳性.1.3.4 农杆菌介导转化法 D e-G r o o t等[19]1998年首次用该法转化了丝状真菌(曲霉启动子),但转化率很低.此后,用双孢蘑菇的幼嫩菌褶组织、菌丝体和担孢子萌发菌丝与农杆菌(A g r o b a c t e r i u m)共培养,获得了稳定的转化子,转化率高达30%～40%,表明同源启动子转化率高[20-21].L e a c h等[11]使用该法以菌丝组织为转化材料转化了双孢蘑菇和枯草杆菌(芽胞杆菌(B a c i l l u s u b t i l i s)(E h r e n b e r g)C o h n)抗潮霉素标记基因(H p h),避免了以原生质体为转化材料的缺点.1.4 存在问题目前在食用菌的转化研究中主要存在假阳性菌落的干扰、外源D N A整合率、外源基因整合后表达率不高以及转化子不稳定等问题.其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率.因此在未来食用菌转化研究方面仍然需要继续探讨转化方法、转化材料、标记基因、启动子等,建立一个完善的转化体系,如引入特殊序列、构建高效表达载体、使用增强子等.从而提高遗传转化的整合率和表达率.2 D N A分子标记研究随着分子生物学技术的发展,目前已经开发了几十种基于D N A序列多态性的分子标记,如随机扩增多态性(R A P D )、扩增片段长度多态性(A F L P )、简单序列长度多态性(S S L P )、简单重复序列间扩增(I S -S R )、序列标记位点(S T S )、单核苷酸多态性标记(S N P )、特征片段扩增区域(S C A R )、核糖体D N A (r D -N A )、相关序列扩增多态性(S R A P )、靶位区域扩增多态性(T R A P )等,并应用于食用菌的种质资源与菌种菌株鉴定、遗传多样性与亲缘关系分析、遗传图谱构建及基因定位和克隆等研究领域.2.1 在杂交子、融合子鉴定中的应用大多数食用菌的遗传背景不清楚,其形态特征也难于观察和描述,使食用菌育种和遗传分析因缺乏标记而难以深人.分子标记的应用,使食用菌的遗传育种研究有了飞速的发展.在杂交育种中,亲本菌株的选择和对杂种的准确鉴定是关键技术,通常传统的鉴定方法不能从本质上揭示亲本固有的遗传差异,因而在准确性、稳定性或灵敏性方面都不太理想.K h u s h 等[22]1992年首次报道了采用聚合酶链式反应(P C R )技术构建双孢蘑菇的分子标记.之后R A P D 、A P -P C R 、r D N A 、S C A R 等分子标记也被相继应用于双孢蘑菇、香菇、金针菇(F l a m m u l i n a v e l u t i p e s S i n g .)、凤尾菇(L e n t i n u s s a j o r -c a j u )、黑木耳(A u r i c u l a r i a a u r i c u l a U n d e r w )、野蘑菇(A g a r i c u s a r v e n s i s )以及褐色蘑菇(A g a r i c u s b i s p o r u s )等食用菌研究中[23-34].用R A P D 技术对香菇的亲本与后代之间进行遗传相关性分析,发现非对称杂交的后代遗传距离与单核受体较近,与双核供体遗传距离较远[35];双单杂交菌株后代基因组也存在不同程度变异[36].2.2 在菌种及种质资源鉴定上的应用目前在食用菌生产上主要存在品种退化、菌种老化、病毒感染、品种混杂和杂菌污染等问题,尤其是同种异名、异种同名的现象十分普遍.分子标记技术的发展,给快速鉴定食用菌菌种及种质资源带来方便.R A P D 技术是一种快速有效鉴别菌株的方法,广泛应用于金针菇、香菇、木耳、白灵侧耳(P l e u r o t u s n e b r o d e n s i s Q u él )、灵芝(G a n o d e r m a )、银耳(T r e m e l l a f u c i f o r m i s B e r k )、牛肝菌(B o l e t u s e d u l i s B u l l .e x F r .)等的子实体及组织分离物的D N A 多态性分析[37-47].此外S R A P 、I T S(I n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r )、I S S R 等方法也有应用[46-50].如秦莲花等[44]以I S S R 引物对香菇属的13个菌株的微卫星区D N A 进行扩增,确认了香菇中微卫星(T A T G )n 序列的存在,认为此标记可用于香菇菌株的遗传分类研究.2.3 食用菌性状的连锁标记筛选与遗传图谱目前,找到与食用菌一些性状相连锁的分子标记比较少.而在遗传图谱研究方面,近年来用分子标记仅构建了双孢蘑菇和糙皮侧耳的遗传连锁图[51-52].双孢蘑菇的遗传连锁图是一个集同工酶、R F L P 、R A P D 、r D N A 重复序列以及少量外部表型性状等多种标记的混合标记连锁图,它的建立将为今后进一步分析双孢蘑菇的遗传行为,定位或克隆有关基因提供了一个很好的参照标尺[34,53-54].糙皮侧耳的遗传图谱以R A P D 标记为主,辅以R F L P 、同工酶、表型(交配因子)标记,该图谱包括了189个位点,分属11个连锁群,覆盖的基因组总长度为1000.7c m ,标记间平均距离为5.3c m .最近又构建了二极交配型P h o -l i o t a n a m e k o 的不亲和性相关蛋白基因(H o x 1)的连锁图[55].此外用白色金针菇子实体和黑木耳不同交配型的单倍体菌株进行R A P D 分析找到了连锁基因[56-57].2.4 食用菌遗传多样性研究目前,通过分子标记揭示不同物种D N A 分子水平上的多态性用于食用菌野生种质资源的收集、保存、评价和利用,以及食用菌种质资源的生物多态性和遗传多样性,已成为食用菌遗传育种领域中一个重要的研究方向.应用R A P D 、R F L P 等分子标记在香菇、双孢蘑菇、侧耳、金针菇、柳松菇(A g r o c y b e c y l i n d r a -c e a )、羊肚菌(M o r c h e l l a e s c u l e n t aP e r s .)、松茸(T r i c h o l o m a m a t s u t a k e )、秀珍菇(P l e u r o t u s p u l m o n a r i u s )、乳菇(L a c t a r i u s d e l i c i o s u s G r a y )等的研究报道较多[3,38,58-63].另外,应用分子标记进行真菌遗传多样性和亲缘关系分析在灵芝属(G a n o d e r m a )、蜜环菌属(A r m i l l a r i a )、块菌属(T u b e )、木耳属(A u r i c u l a r i a )、鹅膏菌属(A m a n i t a )等属种上也有一些报道[64-65].利用I S S R 标记研究松口蘑(T r i c h o l o m a m a t s u t a k e )和隐花青鹅膏菌(A m a n i t a m a n g i a n a )的居群遗传结构,结果表明遗传变异主要表现在同年生子实体内,隔年生子实体的变异情况也有表现;此外,隔年生子实体的遗传相似性和空间分布关系不完全相同[65].有学者[66-71]用I S S R 、R E L P 、R F L P 技术对高卢蜜环菌(A m i l l a r i a g a l l i c a )、侧耳属菌株、双孢蘑菇、白灵菇(P l e u r o t u s n e b r o d e n s i s Q u él )、草菇等多个菌株间的遗传系统进化关系进行了研究,发现双孢蘑菇居群和侧耳属菌株存在很高的遗传多样性,而草菇菌株间遗传差异性小.在食用菌遗传改良过程中,寻找和收集遗传变异丰富的种质资源,以及最大限度地开发利用现有的种55 第3期黄小丹,等:食用菌分子生物学研究进展56仲恺农业工程学院学报第22卷质资源至关重要.种质资源的全面而有效评估是一个非常复杂的问题,将现代分子生物学技术结合传统的形态学、生理学研究方法,形成一套有效的从生理形态到细胞、基因水平的种质资源评估方法,将对食用菌的遗传改良起重要作用.2.5 食用菌基因克隆研究目前在食用菌上克隆的基因不是很多.取得成功的主要有草菇漆酶基因和内切葡聚糖酶基因、香菇线粒体加工肽β亚基基因和疏水蛋白基因、灰盖鬼伞突变体i c h i j i k u开伞基因等,并对其基因序列特征和表达特性进行了分析[72-78].3 展望在分子水平上对食用菌遗传物质进行改造所创造的新物种在自然演化中不一定能出现,但作为一种可控的育种手段,必将在食用菌育种中发挥重要的作用.但同时也应看到许多技术自身存在的局限性和不足,如R A P D标记技术存在假阳性高、稳定性和重复性差等缺陷,R F L P和A F L P的操作复杂、周期长、费用高等.而且目前开发的分子标记数量不足,很难找到与目标基因紧密连锁的分子标记,从而构建高精密度遗传图谱的难度很大.随着分子标记技术的深入,更多的食用菌功能基因将被标记,更高密度、更为实用有效的遗传连锁图谱将被建立,大量重要的基因将被定位、分离和克隆,这将为进一步培育高产、优质、抗病、耐贮的食用菌新品种奠定良好的基础.参考文献:[1] 卯晓岚.中国经济真菌[M].北京:科学出版社,1998.[2] 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真菌分子生物学和遗传学研究
真菌分子生物学和遗传学研究第一章：概述真菌是一类包括酵母、霉菌、子囊菌、夏威夷菌等多种生物的总称。
真菌具有广泛的生物学功能和应用价值，它们是自然界的重要分解者，可以分解食品、化学纤维、纸张等有机物质，并在环境保护、医学、食品、农业、工业等领域有着广泛的应用。
真菌的分子生物学和遗传学研究是了解和应用真菌的基础。
第二章：真菌分子生物学研究1.基因组学随着高通量测序和生物信息学技术的不断发展，真菌基因组学研究取得了长足进展。
已经对多种真菌的基因组进行了全面测序，如酿酒酵母、多面体霉、拟青霉、枯草芽孢杆菌等。
这些基因组的测序数据为真菌的分子生物学和遗传学研究提供了丰富的信息和工具。
2.转录组学转录组学是研究生物体基因转录活动的学科，通过对某一时间点或条件下的RNA分析，可以了解基因表达的变化情况。
真菌转录组学研究已经广泛开展，如对真菌逆境应答、真菌发酵代谢等方面的转录组学研究。
3.蛋白质组学蛋白质组学是在基因组学和转录组学基础上，研究生物体内所有蛋白质的数量、种类、结构和功能等方面的学科。
真菌蛋白质组学研究已经在生物学研究、医学诊断、新药发现等方面得到了广泛应用。
第三章：真菌遗传学研究1.基因编辑技术CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种现代化分子遗传学技术，可以编辑真菌基因，实现基因靶向修饰或编辑。
这项技术已经在酿酒酵母、拟青霉等多种真菌中成功应用，并在基因工程和新药发现方面具有广阔的应用前景。
2.表观遗传学表观遗传学研究的是除DNA序列外，遗传变异可以影响基因表达和功能的其他遗传因素。
表观遗传学在真菌分子生物学和遗传学研究中得到了广泛应用，如DNA甲基化、染色质修饰和非编码RNA等方面的研究。
3.基因连锁和遗传图谱基因连锁和遗传图谱是通过对同一种真菌中个体DNA序列的比对，找到基因间的相关性，构建出真菌基因组中各个基因的相对位置和连锁关系，为基因功能研究和基因定位提供依据。
第四章：应用与前景真菌分子生物学和遗传学研究为真菌在医学、生物学、环境保护、农业、食品等领域的应用提供了基础。
TBP分子标记技术的原理及应用研究进展
TBP分子标记技术的原理及应用研究进展作者：吴丽群张延明赵丽杰来源：《江苏农业科学》2020年第09期关键词：TBP;β微管蛋白基因;分子标记;遗传多样性;种质资源亲缘关系DNA分子标记技术因多态性高、检测方法简单、快速、表达产物不依赖于植物的发育阶段和环境因素等优点，在作物遗传连锁图谱构建、重要性状基因定位与克隆、种质资源遗传多样性与系统发育分析、品种指纹图谱绘制及遗传纯度检测等方面应用广泛[1-2]。
遗传多样性是种内不同种群之间或一个种群内不同个体的遗传变异程度。
遗传多样性的评估对于研究生物多样性、种群动态和生态关系非常重要，可以为研究物种起源、品种分类、亲本选配、品种保护等提供依据，是支持新品种开发和研究，保护和利用现有种质资源的重要基础[3-5]。
随着基因组学的发展，基于特定基因家族或基因潜在可变区域来评估遗传变异的技术已得到广泛应用，此方面的研究已在多种植物中报道过，其中内含子长度多态性（intron length polymorphism，简称ILP）是研究特定基因家族内含子的有效工具[6-7]。
内含子为非编码序列，更容易积累变异，且内含子的位置在物种间存在高度保守性[8]。
微管蛋白基因家族对维持细胞的形态和功能及植物的正常生长发育具有重要调节作用，而且广泛参与调节植物的生物和非生物胁迫[9-11]。
有研究发现，植株的矮化与植物体中微管的减少、变短和分离相关[12]。
侯董亮等研究表明，转录本号为PCP044487.1的β微管蛋白基因可能与梨矮生性状形成的分子调控有关[13]。
张海月等的研究结果表明，来自苹果的β微管蛋白基因家族成员之一（转录本号为MDP0000749824.1）的表达水平，可能受激素调控的作用进而对茎的伸长生长造成影响等[14]。
因此，对β微管蛋白基因家族进行研究具有重要意义。
基于微管蛋白多态性（tubulin-based polymorphism，简称TBP）分子标记技术是通对植物β微管蛋白家族基因DNA内含子的长度来评估遗传变异，对于植物物种遗传多样性分析和植物分类学来说是非常有效的[15-18]。
食用菌DNA分子标记研究的十年历程回顾
了遗传多样性研究。为香菇的亲缘关系分析和菌株鉴定提供了依据。徐学锋、林芳灿嗍测定了中国的５９个
野生香菇菌株ｒＤＮＡ的ＩＴＳ区域序列，发现自然群体不同菌株的ＩＴＳ序列存在相当程度的变异，可以根据
ｌ佟序列差异将不同菌株划分为不同的谱系。认为ＩｆＩＳ序列分析是研究香菇的系统发育和生物地理学的有
效手段。詹才新等ｆ，对来源于不同地区双孢蘑菇菌株的ＲＡＰＤ分析发现它们的遗传变异不丰富，认为可能
ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）和基因组总ＤＮＡ的进行了研究，供试菌株分为四大类。为草菇的育种提
供了科学依据。
２４卷
边银丙等：中国食用菌ＤＮＡ分子标记研究的十年历程回顾
１７
５分子标记在食用菌线粒体遗传研究中的应用
稻瘟病(Magnaporthe grisea)研究进展图片
• 在多种杂草种病原M.grisea中说明与PWL2有同 源性的DNA序列的分布。
• 水稻的多数病菌和马唐属的病菌含有与PWL2 相似的同源序列。
• 稷属病菌同源性较少。
• 含有PWL1基因的病菌与PWL2有较少同源性片 断，这种同源性导致克隆PWL1基因的全部功 能。
•
• 第二个惰性基因，PWL3，来自同一稷属 病菌和另一个惰性基因PWL4来自弯叶画 眉草，都已克隆。克隆的PWL3基因编码 一个无活性的蛋白质，PWL4基因编码一 个活性的蛋白质，但不表达
四．寄主专化性的遗传控制
• 1. PWL寄主专化基因族 • 2．AVR2-YAMO无毒基因族
• 遗传分析鉴定2个基因，来自狗尾草病菌的 PWL1 ， 来 自 水 稻 病 菌 的 PWL2 ， 各 自 对 M.grisea菌系侵染弯叶画眉草能力起主要作用。
• 在水稻致病系统是典型的基因对基因系统，病 菌中的AVR基因与寄主中特定的抗病基因功能 性表现对应关系。
• 这种不稳定性也在减数分裂时发生。
• 在M.grisea变异潜在机制包括像B染色体， 准性循环，或在双链RNAS多态性。
• 在病菌中遗传不稳定看来与基因组不稳 定区频繁的正常发生的缺失和其他突变 有关。
• 在其它一些情况中，至少在实验室研究 中，转位也导致变异。
1．与染色体位置相关的不稳定 性
六．结论
• 插入诱变技术正在鉴定，致病性或孢子 形成的所要求的基因。
• 不同的cDNA 克隆技术在鉴定附着胞形成 期间所表达的一些基因或病菌在寄主植 物侵染性生长期表达的一些基因。
• 使用基因干扰技术突变分析已有可能鉴 定克隆的一些基因的功能。
• 主要的突破将来自发现单个AVR基因作用，例 如PWL2和AVR2-YAMO对病菌起什么作用。
基于全基因组序列的香菇商业菌种SSR遗传多样性分析及多位点指纹图谱构建的研究
基于全基因组序列的香菇商业菌种SSR遗传多样性分析及多位点指纹图谱构建的研究香菇（Lentinula edodes）是世界主要栽培食用菌之一，香菇菌种的准确鉴定是香菇大规模生产和菌种知识产权保护的重要前提。
本研究基于香菇全基因组序列开发200对SSR标记用于25份常用香菇栽培菌种的遗传多样性分析和菌种鉴定。
结果表明：供试材料的遗传相似性较高，遗传相似系数平均值为0.776，最小值为0.567，最大值为1。
基于遗传多样性分析结果，筛选出7对带型清晰且重复性好的SSR标记，并成功构建了11份香菇商业菌种的多位点SSR指纹图谱。
这11份菌种分别为：Cr02、闵丰1号、香菇2414、森源1号、森源8404、香九、广香51号、华香5号、L952、L9319、L808。
香菇；简单重复序列；商业菌种；遗传多样性；指纹图谱香菇（Lentinula edodes）是我国十分重要的栽培食用菌。
自上世纪70年代以来，随着品种改良以及代料栽培技术的推广，我国香菇总产量有了极大的提高，逐渐占到世界总产量的70%以上[1]。
据中国食用菌协会统计，2012年我国香菇总产量达到400万吨，仅次于糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus），是我国第二大栽培食用菌。
随着香菇栽培规模的逐步扩大，香菇栽培菌种的使用数量也越来越多，目前已有25份香菇菌种通过了国家品种审定委员会的认定，用于大规模的商业生产。
对于香菇产业来说，优质的菌种对香菇产量和质量的贡献至关重要。
目前，我国的香菇栽培正逐步从分散的小农小户生产向着专业化、分工化、规模化的方向发展，对香菇栽培菌种的质量和真实性要求越来越严格。
由于缺乏简洁高效的菌种检测手段，生产上假菌种、退化菌种时常冒充优良商业菌种流通于市场，导致菌种供应者和香菇生产者遭受巨大经济损失，迫切需要研制简便、快速、准确的菌种鉴定技术，以保证生产用种的准确无误。
菌种的真实性常通过基于表型分析的DUS（Distinctness，Uniformity and Stability）测试来鉴定。
rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用
rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥【摘要】采集了四川马尔康地区3种真菌,根据其形态学特征结合卯晓岚的《中国大型真菌》图谱,初步确定其疑似为黄菇、松乳菇、红菇3个种.为提高鉴定的准确性,通过构建基因池;用特异性引物进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序;将测得的实验样品的序列在GeneBank中进行BLAST比对;并与相似性较高的已知的种,利用DNA-MAN、Clustalx1.83和MEGA5.0软件采用N-J法构建进化树,探寻他们与已知物种的相关关系.结果表明,三种疑似菌株扩增出的目的条带为500-750bp,J1、J2、J3号菌株分别与臭黄菇、松乳菇、红菇的序列相似度最高.并利用序列的相似性做出了它们各自的进化树.最终得出结论:J1号菌株为臭黄菇(Russula foetens),J2号菌株为松乳菇(Lactarius deliciosus),J3号菌株为红菇(Russula.).利用rDNA-ITS序列分析法和形态学分类法相结合的方法鉴定菌种,不仅丰富了三种真菌的基因库,而且也克服了单纯的rDNA-ITS序列分析法因受基因库的完善程度、高度相似性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等限制而不能鉴定出所有真菌的缺点,提高了真菌分类鉴定中一些模糊性状的区分度.【期刊名称】《西华师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(037)003【总页数】6页(P264-269)【关键词】真菌;鉴定;rDNA;ITS;PCR;测序【作者】朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥【作者单位】西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009【正文语种】中文【中图分类】Q939.5传统的真菌鉴定方法主要通过培养后观察菌落形态和显微特征，或辅以生理、生化、营养实验来鉴定。
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大型真菌分子遗传连锁图谱研究进展集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]大型真菌分子遗传连锁图谱研究进展刘伟肖扬边银丙*华中农业大学应用真菌研究所武汉 430070A review of research advance of molecular genetic linkage map in macrofungiLIU Wei XIAO Yang BIAN Yin-Bing*The Institute of Applied Mycology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China大型真菌（macrofungi）中包括一些重要的食用真菌和药用真菌，在人类的经济生活中占有十分重要的地位（Chang & Miles 1989）。
真菌学研究是生物学研究中的一个重要分支，但对大型真菌遗传学的系统研究目前仍集中在少数分类单元中，例如子囊菌中的链孢属Alternaria、Neurospora及担子菌中的鬼伞属Coprinopsis和裂褶菌属Schizophyllum（Peever et al. 1999；Nargang & Rapaport 2007；Kües 2000；Clark & Anderson 2004）。
近年来，随着现代生物学研究技术和方法的飞速发展，真菌分子生物学研究也不断深入，在系统发育、遗传作图、基因定位、基因克隆及遗传转化等方面都有了长足的发展（Hamer & Givan 1990；Zhong et al. 2002；Fincham 1989）。
分子遗传连锁图谱（genetic linkage map）是基因组内反映基因以及专一性多态性DNA标记相对位置的图谱，能显示标记和基因在染色体上的相对位置，有利于更好地理解基因组结构和进化，是进行基因组系统研究的基础，也是遗传学研究的重要方向（Botstein et al. 1980；Marra et al. 2004；de Vos et al. 2007；Manzo-Sánchez et al. 2008；Xu et al. 2009）。
遗传连锁图谱的构建以及建立在此基础上的数量性状（quantitative trait loci）定位成为了现代遗传学研究中的热点（Lander & Botstein 1989；Liu et al. 2004；Fischer et al. 2004；Welter et al. 2007）。
1 大型真菌分子遗传图谱研究的现状真菌遗传图谱的构建工作较高等动植物起步晚，研究基础相对落后，其构建方法主要参考高等动植物。
构建过程包括：1）确定作图群体及亲本的组合；2）培养大量遗传标记处于分离状态的分离群；3）确定作图群体中不同个体基因型；4）选择合适的分子遗传标记；5）构建标记间的遗传连锁群。
大型真菌分子遗传图谱的构建工作最早始于Kerrigan et al.（1993）对双孢蘑菇Agaricus bisporus的遗传研究。
随后糙皮侧耳Pleurotus ostreatus（Larraya et al. 2000）、香菇Lentinula edodes（Terashima et al. 2002；Kwan & Xu 2002；Terashima et al. 2006；et al. 2008）、灰盖鬼伞Coprinus cinereus（Muraguchi et al. 2003）、双色蜡蘑Laccaria bicolor（Labbé et al. 2008）、肺形侧耳Pleurotus pulmonarius （Yasuhito et al. 2009）和Amylostereum areolatum（van der Nest et al. 2009）等图谱的构建工作也相继展开。
据统计，目前公开发表的大型真菌遗传连锁图谱仅有14张（表1），而国内还未见有相关的研究报道。
双孢蘑菇和香菇是两种重要的食用菌，也是大型真菌遗传学研究中研究比较深入的食用菌。
表1 大型真菌遗传连锁图谱构建情况Table 1 Construction of macro-fungi genetic linkage map物种Species 构图群体Population遗传标记Geneticmarker连锁图谱Genetic linkage map参考文献Reference标记数Number覆盖长度Length(cM)连锁群数Linkagenumber平均图距Averagedistance(cM)双孢蘑菇Agaricus bisporus52RAPD、RFLP6411/Kerrigan etal. 1993 103SCAR、Others7281/Callac etal. 1997121RAPD、SCAR265/Moquet etal. 1999118AFLP、SSR、CAPS、Others320115613Marie etal. 2010双色蜡蘑Laccaria bicolor 45AFLP、RAPD、SSR、SNP29481213Labbé etal. 2008糙皮侧耳Pleurotus ostreatus 80RAPD、RFLP20311Larraya etal. 2000 80RFLP、Others99106111/Park et al.2006肺形侧耳Pleurotus 150AFLP30097112Yasuhito etal. 2009pulmonarius 灰盖鬼伞Coprinus cinereus 40RAPD、RFLP247134613/Muraguchiet al. 2003香菇Lentinula edodes 95AFLP20311Terashimaet al. 2002 32RAPD、SSCP6914Kwan & Xu200295AFLP-H16611Terashimaet al. 2006 92RAPD、SSCP、SCAR28911et al.2008Amylostereum areolatum 80AFLP204169325van derNest et al.2009双孢蘑菇遗传连锁图谱的构建双孢蘑菇在西方国家己有300多年的栽培历史，而且对它的研究也较为深入。
双孢蘑菇的担孢子多数为异核体，仅有少量的同核体，获得用于分析子代重组率的单倍性同核体较为困难（Elliott 1985；Moquet et al. 1998）。
Kerrigan et al.（1993）在1993年构建了双孢蘑菇的第一张遗传图谱，作图群体由52个个体组成，其中包含从671个单孢分离物中获得的48个同核体，1个异核体单孢（n+n）以及通过这个异核体单孢原生质体再生获得的3个同核体（n）。
利用包括同工酶标记、RAPD标记、RFLP、rDNA标记以及少量表型性状在内64个标记，得到11个连锁群，其中9个连锁群通过核型电泳和点杂交可以与对应的染色体相吻合。
该图总长度有543.8cM，与染色体物理距离之比大约为cM，覆盖了基因组的大部分。
Callac et al.（1997）利用来自JB3-83×U1-7杂交的后代103个同核体作为群体，构建了染色体I的连锁图。
该图跨度28cM，有4个源自RFLP的SCAR标记和一个异型酶羧肽酶位点PEP2，一个交配型座位MAT以及担孢子数量位点BSN。
染色体I的遗传图谱是对Kerrigan et al.（1993）在1993年所构建的双孢蘑菇遗传图谱的进一步丰富和补充，也表明了由不同作图群体构建的遗传图谱可以在遗传标记的定位上找到切入点，进行对比研究和使用。
Moquet et al.（1999）将JB3-83×U1-7的子代同核体群体数量扩大到121个，通过SCAR、RAPD和同工酶乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）标记分析，将26个标记定位在5个连锁群上。
与Callac et al.（1997）构建的图谱比较发现，在相同的连锁群上（连锁群I）相同标记间的距离增大，标记间的顺序有变。
研究表明群体数量的选择至关重要，它会影响到标记之间的准确定位。
Marie et al.（2010）用双孢蘑菇异宗结合突变株A. bisporus var. burnettii和次级结合变异株A. bisporus var. bisporus的种内杂交获得的118个同核体，用31个AFLP、21个SSR、68个CAPS和MAT、BSN、PPC1、ADH基因标记，构建了一张覆盖度为1,156cM、平均图距为3.9cM，共13个连锁群的连锁图谱，与染色体物理距离之比大约为cM，这也是双孢蘑菇第一张详尽的分子遗传连锁图谱。
双孢蘑菇总遗传图谱长度（L e）估计在1,256cM，据此估计，在这张连锁图中，以20cM的距离间隔存在一个标记的话，此图能覆盖双孢蘑菇99%的基因，以10cM一个标记为间隔，将能覆盖双孢蘑菇93%的基因。
香菇遗传连锁图谱的构建香菇是年产量仅次于双孢蘑菇的世界第二大食用菌（Lin et al. 2000），属于四极性异宗结合担子菌，其交配系统由2个非连锁的交配型因子A与B控制（Tokimoto et al. 1973；Murakami & Takemaru 1975）。
早期的香菇遗传图谱是用形态标记和生化标记所构建的（Hasebe 1991；Bowden & Royse 1991）。
2002年，Kwan & Xu（2002）最早构建了香菇的分子遗传连锁图，亲本菌株L-54采用原生质体单核化处理后获得两种不同交配型（A1B1、A2B2）的单核体，作图群体为32个F1（L-54A1B1×A2B2）的孢子单核体，共采用62个RAPD标记，3个基于BSA（bulked-segregant analysis）的RAPD标记，2个表型位点（Mat-A、Mat-B），1个基因（priA）位点和1个测序的DNA片段位点（MAT）构建了14个连锁群，该图谱的总长度为622.4cM，平均图距9.0cM。
Terashima et al.（2002）2002年构建了香菇的AFLP连锁图。
作图群体为亲缘关系较远的2个菌株杂交后所得的95个单孢子后代，该图有203个AFLP 标记和2个交配型因子，共鉴定了11个连锁群，其中有8个大连锁群和3个小连锁群，遗传图谱总长度为1,956.7cM，平均约cM。
Terashima et al.（2006）之后通过高效基因组扫描（high-efficiency genome scanning）电泳系统得到的AFLP标记（AFLP-H）及一些功能位点的整合，进一步完善了于2002年构建的连锁图，该图仍为11个连锁群。