第10章-基因工程的操作过程
2、过程:
质粒
分子
同一种 限制酶处理
一个 切口 两个 黏性末端
两个 切口 获得目的基因
连接酶 重组（重组质粒）
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
（1）农杆菌转化法
①农杆菌：
植物的受伤组织会产生一些糖 类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受 伤组织集中 ，使植物形成肿瘤。
此类物质主要在双子叶植物细胞壁 中合成，通常不存在于单子叶植物中 ， 农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物， 对大多数单子叶植物没有感染能力。
（1）农杆菌转化法
②原理：
质粒上的可以转移到受 体细胞，并整合到受体细胞 染色体的上。
第十章 基因工程的操作过程
第一节、表达载体的构建及导 入
目的：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并 且可以遗传给下一代。 ②使目的基因能够表达和发挥作用。
一、表达载体的构建 科学家在培育抗虫棉时，经历了多次 失败，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插 入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中， 结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启 动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵， 长成的棉花植株还是没有抗虫能力。 科学家又在有启动子、抗虫基因的质 粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉
微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
过程：
2+处理大 肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态 细胞吸 收
细菌能够吸收的状态
受体生物 受体细胞
植物
受精卵 体细胞
动物
受精卵
导入方法
农杆菌转化法 基因枪法
花粉管通道法
显微注 射技术
微生物
细胞/个体
用2+处理成感 受态细胞
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自 身基因的启动子才能比导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一 些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率 的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任 何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
2.将目的基因导入动物细胞
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 显微注射
受精卵 早期胚胎培养
移植到子宫
新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：2法（ 2+增加细菌细胞的通透性）
常用菌：大肠杆菌
100 菌体培养至600 = 0.5，离心收集菌体 用10 冰冷的20 2溶液悬浮菌体，离心 收集菌体 用1 冰冷的100 2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用
2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：
取100 感受态细胞，加入相当于50 载体的重组 连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
标记基因：为了鉴别受体 细胞中是否含有目的基因， 从而筛选出有目的基因的 受体细胞。
启动子 目的基因
表达载体
终止子
复制原点 标记基因
表达载体的模式图
注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因 和复制原点两部分片段。表达载体在载体基础 上增加了 目的基、因 启、动子 终止三子部分 结构 ②用到的工具酶：既用到 限制酶 切割载体， 又用到 连接酶 将目的基因和载体拼接， 两种酶作用的化学键都是 磷酸二酯键 。 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表 达载体的方式携带进去。
表 b、启动子 达 c、终止子 载 体 d、标记基因
e、复制原点
启动子 目的基因
表达载体
终止子
复制原点 标记基因
表达载体的模式图
启动子：位于基因的首端的一段特殊的片断，它是聚合 酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出，最 终获得蛋白质。
终止子：位于基因的尾端 的一段特殊的片断，能终 止转录。
二、将目的基因导入受体细胞
（一）转化：目内的维基持因 和进 的入 过内 程受稳，体定并细且胞在表达受体细胞
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 动物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
——显微注射法
将目的基因导入 微生物细胞
——氯化钙法（感受 态细胞）
1.将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
柱头
雌 蕊 花柱
胚珠 子房
子房壁
花药
雄 蕊
花丝
子房的结构
子房壁
珠被 珠心
胚
（胚囊）
珠
极核
卵细胞
滴加目的基因溶液
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发 后，花粉管要穿过花柱直通 胚囊。花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形成的花 粉管还未愈合前，剪去柱头， 然后，滴加（含目的基因）， 使目的基因借助花粉管通道 进入受体细胞。
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接 纳外源的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采 用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移 质粒或重组分子
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进 行转化
电穿孔转化
③转化过程:
质粒
构建
表 达
转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物 细 胞
插入
植物细胞 染色
表达
新 性 状
（2）基因枪法
适用于单子叶植物
基因枪法又称微 弹轰击法，是利用压 缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表 面的表达载体打入受 体细胞中，使目的基 因与其整合并表达的 方法。
（3）花粉通道法 适用于被子植物
转化的原理与技术
2+诱导的完整细菌细胞的转化
2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性 细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其 原理是2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构， 后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙， 细菌细胞此时的状态叫做感受态
2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备：
基因工程操作步骤
基因工程操作步骤
基因工程是一种利用分子生物学技术对基因进行修改或操作的科学技术，包括四个主要步骤：DNA提取、DNA插入、细胞转化和筛选鉴定。
第一步：DNA提取
DNA提取是从细胞中分离出目标基因的第一步。
首先需要选择合适的来源，比如细菌、动物、植物等。
然后通过处理，如破碎、溶解等，使细胞内的DNA被释放出来，经过纯化和分离，得到纯净的DNA。
第二步：DNA插入
DNA插入是将目标基因插入到宿主细胞中的过程。
将目标基因与载体DNA连接，然后利用特定的酶（如限制酶）进行切割，使其与宿主细胞的某个位点相连。
将该DNA带入细胞内，使其成为宿主细胞的一部分。
第三步：细胞转化
细胞转化是将DNA插入到宿主细胞后，使宿主细胞接受和表达目标基因的过程。
目前流行的转化方法有三种：自然转化、化学转化和电转化。
其中，电转化是最常用的方法，它利用高压电脉冲对细胞进行短暂的电击，使其膜通透性增加，从
而使DNA进入细胞内。
第四步：筛选鉴定
筛选鉴定是用于鉴别宿主细胞是否成功接受和表达目标基因的过程。
利用限制酶切割、PCR扩增、Southern blotting等技术方法，可以检测宿主细胞是否带有目标基因；同时，也可以通过观察目标基因是否表达以及表达程度的多寡，来判断宿主细胞是否成功接受和表达目标基因。
总而言之，基因工程操作步骤需要经过DNA提取、DNA插入、细胞转化和筛选鉴定四个主要步骤，每一步都需要严格控制条件和操作，以保证结果的准确性和可靠性。
基因工程操作的基本步骤
基因工程操作的基本步骤
基因工程是指人为地将外源基因导入到宿主生物体中，并使其在宿主中表达出来的技术。
基因工程的操作一般包括以下基本步骤：
1.确定目标基因：确定想要转入宿主生物体的目标基因，这可能是来自其他生物体的其中一种特定基因。
2.获得目标基因：获得目标基因的DNA序列，通常通过基因重组、合成或从源生物中提取。
3.构建载体：将目标基因插入到一个载体DNA中，以便将其导入宿主生物体。
载体可以是人工合成的质粒或病毒，能够稳定地带有外源DNA。
4.转化宿主生物体：将构建好的载体导入到宿主生物体中，使其接受外源基因。
转化方法可以包括化学方法、电击法、基因枪等。
5.筛选转化体：通过筛选方法，如对转化体进行培养基的筛选、对荧光标记的筛选等，来选出成功转化了外源基因的宿主生物体。
6.验证基因表达：通过PCR、蛋白质表达分析等实验方法验证外源基因是否成功表达。
7.优化表达：根据目的需要，可以通过引入启动子、启动子增强子、终止子等调控元件，优化外源基因的表达。
8.传代培养：将成功表达外源基因的宿主生物体进行传代培养，以使其后代继续表达目标基因。
9.应用研究：将表达目标基因的宿主生物体应用于研究中，如表达重要药物、生产工业化酶、改良农作物等。
基因工程的基本操作程序 课件
限制性酶切割 DNA分子
限制片段 琼脂糖电泳
DNA
带有DNA片段的凝胶
分
用缓冲液转 转移至硝酸纤维素膜上
子
移DNA
杂
凝胶
交
滤膜
与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA片 段的膜
放射自显影
抗原-抗体杂交
重组体
转化到 E.Coli
细菌启动子 插入的真核 DNA片段
解析：DNA 分子杂交就是不同来源的 DNA 分子的单 链按碱基互补配对原则结合在一起，形成杂合双链的过 程。B 项利用了分子杂交技术(DNA 与 mRNA 之间杂交)。 检测目的基因是否翻译合成蛋白质依据的是抗原—抗体 杂交原理，未用到 DNA 分子杂交原理。
答案：C
生物 种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
转化 过程
将目的基因插入Ti质 粒的T-DNA上→Ca2+ 处理导入农杆菌细胞 →侵染植物细胞→目 的基因整合到受体细 胞的染色体上DNA上 →植物组织培养→试 管苗表达目的基因→
产生相应性状。
将含有目的基因
的表达载体提纯 →取受精卵→显 微注射→获得导 入目的基因的受 体细胞→早期胚 胎培养→胚胎移 植→获得新性状
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化 transformation） 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）微生物作为受体的优势
①繁殖速度快，可大量生产 ②生产成本低
（2）导入方法 Ca2+处理
第三步：将目的基因导入受体细胞（转化 transformation） 3、将目的基因导入微生物细胞 （3）原核生物作为受体细胞产生的蛋白质没有空间结构， 需要在体外加工。
基因工程基本操作过程
基因工程基本操作过程基因工程基本操作过程基因工程（Gene Engineering）是指使用分子生物学技术来改造细胞的过程。
下面我们将介绍基因工程的基本操作过程：一、制备基因：1、搜集基因：首先根据要求选择合适的基因来构建一个基因组。
2、克隆基因：将选定的基因提取出来并复制多份，使得可以获得相当数量的基因，以便后续的基因工程。
3、比较基因：对不同基因的序列进行比较，以了解基因的相似性和差异性，这是判断基因是否有用的重要依据。
4、无编码的RNA转录：将DNA 序列转录成RNA 序列，以及无编码RNA（rRNA）的转录，其中，rRNA 是控制基因表达水平的重要因素之一。
二、构建基因组：1、生成基因组：将制备的基因进行拼接成合适的串联，形成某一特定的基因组。
2、调节基因表达：通过调节基因组中基因的表达水平，使其达到适当的状态，以获得最大的效果，可以采用基因转录调节、基因表达调节等技术。
3、重组基因：改变基因组中基因的构型或序列，从而得到新的可用基因，可以采用重组质粒、 PCR（聚合酶链反应）技术等。
三、进行工程化：1、在细胞中引入外源基因：将制备的基因组注入细胞中，使其形成线粒体遗传系统，从而改变细胞的特性。
2、提取细胞中的基因：从细胞中提取所需要的基因，以便进行分析和研究。
3、可视化基因分析：对细胞中的基因进行可视化分析，以了解基因的结构及作用，可以采用流式细胞术、免疫组化等技术。
四、应用基因工程技术：1、制作新的药物：利用基因工程技术可以设计新的药物，以治疗疾病2、生产更优质的农作物：通过改造作物自身的基因，可以获得更高品质的农作物，提高农业的生产效率。
3、开发先进的器械设备：基因工程技术可以应用于开发先进的机械设备，以提高工程制造的效率和质量。
以上就是基因工程的基本操作过程，在实际应用中，可以结合不同的技术，创新性的进行工程化以实现一定的目的。
基因工程的操作程序
内含子
外显子
能够编码蛋白质的序列叫做外显子
不能够编码蛋白质的序列叫做内含子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
内含子：
外显子：
真核细胞的 基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。
启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
注意
三将目的基因导入受体细胞
（一）转化：
（二）方法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 动物细胞
将目的基因导入 微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
——显微注射法
——感受态细胞
目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程（1）.基因（2）.基因的构建方法
通过对受体菌的培养而储存基因 基因组的构建cDNA的构建-----反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。
目的基因的mRNA
单链DNA
1
2
3
6
5
4
双链DNA (目的基因)
① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术
③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.前提条件：
基因工程主要操作流程及图解
连 接 ：
相 同 限 制 酶 切 位 点
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应 Ⅰ
G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割 Ⅰ
G CCTAG G CCTAG
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割 用 载体 Ⅰ
+
GATCC G GATCC G
T4 DNA 15ºC
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
目的基因
体
载体
分 离 导入
同 切
GATCC G CCTAG G GATCC G CCTAG G
连接
筛 选
检测和 表达
1基因工程操作步骤： 基因工程操作步骤： • 获取目的基因 • 构造重组 DNA 分子 （注意：要用同一种限制酶切载体和目的基因） • 转化或转染 • 表达 • 蛋白质等产物的分离纯化
• 2其主要操作流程可以简述为： 其主要操作流程可以简述为： 其主要操作流程可以简述为 分、切、接、转、筛、表
分：目的基因的获取、载体的选择 切：限制性内切酶切取基因片段和载体接口 接：用连接酶将目的基因基因的阳性克隆 表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物
第10章 基因工程的操作过程
2.将目的基因导入动物细胞
（1）方法：显微注射法（将基因表达载体 提纯，用显微仪注射到受精卵中）
2.将目的基因导入动物细胞
（2）操作程序:
提纯含目的基因表达载体 显微注射
受精卵
早期胚胎培养 移植到子宫 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
常用法：CaCl2法（ Ca2+增加细菌细胞的通透性）
二、将目的基因导入受体细胞
受体细胞 内，并且在 目的基因进入 _________ （一）转化： 表达 的过程 受体细胞内维持稳定 _____和_____ 将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
（二）方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞
将目的基因导入 ——氯化钙法（感受 微生物细胞 态细胞）
载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一
个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。 第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应 抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长， 可将转化子直接从平板上挑出来； 第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素 平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以 生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一 种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。
2、过程:
质粒 DNA分子 同一种 限制酶处理
一个 切口 两个 黏性末端
两个 切口 获得目的基因
DNA连接酶 重组DNA（重组质粒）
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
启动子
目的基因
表 达 载 体
b、启动子 c、终止子 d、标记基因
表达载体
复制原点 标记基因
终止子
e、复制原点
基因工程的操作过程
基因工程的操作过程一、概述基因工程是利用分子生物学、细胞生物学等技术对基因进行改造、合成和修饰的过程。
通过基因工程，可以实现对生物体的遗传信息进行精准地操作和改变，从而创造出具有特定功能或性状的新型生物体。
二、DNA提取在进行基因工程之前，需要先从目标生物体中提取出其DNA。
DNA提取是一个关键步骤，它决定了后续操作的成功率和效果。
1. 样品采集首先需要从目标生物体中采集样品。
样品可以是血液、组织、细胞等。
2. 细胞破碎将采集到的样品放入离心管中，加入裂解缓冲液并振荡破碎细胞壁使DNA释放出来。
3. DNA纯化通过离心等方法将杂质去除，使得纯化后的DNA可用于后续操作。
三、PCR扩增PCR（聚合酶链式反应）是一种利用酶的作用扩增目标DNA序列的技术。
PCR扩增可以将目标DNA序列扩增到足够多的数量，便于后续操作。
1. 反应体系准备将PCR反应体系中所需的酶、缓冲液、引物和模板DNA等混合均匀。
2. 反应条件设置根据所需扩增的DNA序列长度、GC含量等因素，设置PCR反应的温度、时间和循环次数等参数。
3. PCR扩增将反应体系放入PCR仪中进行扩增，经过若干轮循环后，可得到大量目标DNA序列。
四、限制性内切酶切割限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并对其进行切割的酶。
通过使用不同的限制性内切酶，可以实现对目标DNA序列的精准切割和拼接。
1. 酶切体系准备将限制性内切酶加入到目标DNA溶液中，并加入适量的缓冲液和辅助物质。
2. 酶切条件设置根据所需的酶切位点和目标DNA序列特点，设置相应的温度、时间等条件。
3. 酶切反应进行将反应体系放入恒温水浴中进行反应，待反应结束后可得到经过精确切割后的DNA片段。
五、质粒载体构建质粒载体是一种能够在细胞内进行复制和表达的DNA分子。
通过将目标DNA序列与质粒载体进行连接，可以实现对目标基因的表达和功能调控。
1. 质粒载体准备选择适合的质粒载体，并进行线性化处理。
基因工程的基本操作步骤
基因工程的基本操作步骤1.获得目标基因：确定所需的目标基因，可以通过从已知基因库中克隆目标基因，或者通过后续的基因特异性扩增来获得目标基因片段。
2.克隆和扩增目标基因：将获得的目标基因片段插入到载体（如质粒、病毒等）中，通过体外扩增技术（如聚合酶链式反应，PCR）增加目标基因的拷贝数目。
3.DNA测序：对扩增的目标基因进行测序，以确认其序列是否和期望的一致。
这对于进一步的克隆和分析十分重要。
4.选择适当的宿主：根据目标基因的特性，选择合适的宿主生物。
可以选择细菌、植物、动物细胞等不同的宿主。
5.转化宿主：将目标基因插入宿主细胞中，使其能够被细胞内的基因表达系统所识别和表达。
6.筛选和鉴定：对转化过的宿主进行筛选，以确定是否成功地将目标基因表达在宿主中。
这可以通过各种技术，如荧光标记、抗性筛选等进行鉴定。
7.基因表达和改造：在宿主中实现目标基因的表达，并进行必要的改造。
这包括调控基因表达水平、改变基因产物的结构和功能等操作。
8.分析和验证：对基因表达和改造的结果进行分析和验证。
这可以通过分子生物学技术、生物化学方法、功能性实验等手段来实现。
9.后续应用：根据实验目的和应用需求，对基因工程产物进行进一步的应用和开发。
这可以涉及到基因工程产品的应用领域，如医药、农业、工业等。
除了上述的基本操作步骤，基因工程还需要进行严格的实验设计、对操作过程进行质量控制和数据分析。
此外，基因工程的操作过程还需要遵守相关的伦理原则和法律法规，确保实验的安全性和合规性。
需要注意的是，基因工程是一个复杂的过程，具体的操作步骤可能因不同的实验目的、技术手段和宿主生物的选择而有所差异。
因此，在实际操作中，可能需要根据具体情况进行调整和优化。
基因工程操作步骤
4.目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
合成
热稳定的DNA聚合酶
特点
半保留复制、 边解旋变复制
半保留复制、 全解旋再复制
结果
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
随堂闯关 PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）: 双链DNA模板 在热作用下， 氢断键裂，形成____单__链_
b、复性（55℃-60℃）: 系统温度D降N低A ，引物 与DNA模板结合，形成局部__双__链____。
③例: 转基因抗虫棉
2.将目的基因导入动物细胞
①方法: 显微注射法
①程序
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因:
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌: 大肠杆菌
③常用法: Ca2+处理获得感受态细胞
④过程:
Ca2+处理 大肠杆菌
1.2 基因工程的基本操作程序
知识回顾: 基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因, 我们才能赋予
1.目的基因的获取 一种生物以另一种生物的遗 传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2.基因表达载体的构建 定存在, 并可进行遗传、表达 和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达,
3.目的基因导入受体细胞 才能实现一种生物的基因在 另一种生物中的转化。