盐酸克伦特罗完全抗原的合成及其偶联工艺的优化
重氮化反应及其应用
3.2.2 重氮盐的叠氮化反应 芳烃重氮化是制备芳香叠氮化物最古老的方
法， 芳基重氮盐与催化剂叠氮离子的直接反应得到 相应的芳香叠氮化物。
3.2.3 形成三氮烯 三氮烯含有 3 个连续连接的氮原子 ， 在 N1 和
N2 间含有 1 个双键 （RN1=RN2-NR′R′′）， 在制备化 学中它是一类通用的化合物， 在许多合成转换中其 适应性强也十分稳定， 目前已被用于抗癌药物与天 然产物合成中的保护基。 三氮烯可用芳基重氮盐与 伯胺或仲胺的偶联而制备， 也可由基金属试剂与叠 氮化合物的加成反应而制得。
在硫酸和磷酸混合物中进行重氮化的方法由 Bermes［9-10］提出， 对于部分 含 有 吸 电 子 基 的 弱 碱 性
胺， 须以亚硝酰基硫酸为亚硝化试剂并以磷酸混合 物作为重氮化介质， 该方法也可用于杂环胺重氮化 反应。 通常是将胺的硫酸溶液加入到亚硝基硫酸的 硫酸溶液中或将磷酸加入到胺和亚硝基硫酸的硫酸 溶液中开始进行， 其反应速率要高于硫酸介质。 2.2.4 盐酸中的重氮化反应
参考文献：
［1］ Butler R N. The diazotization of heterocyclic primary amines ［J］. Chemical Reviews， 1975， 75（2）： 241-257.
［2］ Porai -Koshits B A. The current state of the problem of the structure and reactivity of aromatic diazo-compounds ［J］. Russian Chemical Reviews， 1970， 39（4）： 283-289.
盐酸克伦特罗多克隆抗体和量子点的偶联
ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｕｐｌｉｎｇ，ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅａｋ ｗｉｄｔｈ，ａｂｓｏｒｂａ ｎ ｃｅ ｃｈａ ｎ ｇｅ ｂｉｇ，ｆ ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｂ ｏ ｄｙ ｔｉｔｅｒ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｏｗ，ｂｕｔ ｄｉｄ ｎｏｔ ａｆｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ，Ｔ ｈ ｉｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａ８ ａ ｇｏｏｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｋａｒｅｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｒｕｇｓ ｒｅｓｉｄｕｅ ｓｔｒｉｐ ａｎｄ ｋｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ；ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ ｐｏｌｙｅｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ；ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｗ ＥＩ Ｄｏｎｇ
盐 酸克 伦 特 罗 又 称 “瘦 肉精 ”（ＣＬ），是 白色 或 类 白色 晶 体 粉 状 ，无 嗅 、味 微 苦 ，化 学 性 质 较 为 稳 定 ，属于苯乙醇胺类 Ｂ 肾上腺类神经兴奋剂 。它有 较强 的药性 ，化 学 性 质 稳 定 ，溶 解代 谢 率 低 ，不 易排 出 ，残 留量 较 高 ，大 量 用 在 饲 料 中可 增 强脂 肪 分 解 ， 肉迅 速增 长 ，大大 提 高 了瘦 肉率 ，增 加 瘦 肉产 量 ，虽 说 农 药 、饲 料 添加 剂 、动 物 激 素 等 在 一 定 剂 量 范 围 内使 用 ，可 以为畜 牧业 和经 济 的发 展 起 一定 的促 进 作用 ，但 当其在生物体内含量超过临床用量的 ５一 ｌ０倍 时 ，便会 导 致 畜 禽 中毒 和 大 量 药 物残 留 ，带 来 了相应 的安 全 隐患 … 。研 究表 明 ，过 多食 用 含 有 瘦
盐酸克伦特罗完全抗原的合成及其偶联工艺的优化
2009 年 4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr. 2009文章编号：1003-9015(2009)02-0355-05盐酸克伦特罗完全抗原的合成及其偶联工艺的优化杨香瑜, 黄鹤(天津大学化工学院生物化工系系统生物工程教育部重点实验室, 天津 300072)摘要：为获取用于快速免疫分析的免疫抗原和包被抗原，本实验采用重氮化反应制备盐酸克伦特罗(Clenbuterolhydrochloride, CL)完全抗原，在强酸条件下CL先经重氮化，再与鸡卵清白蛋白(OV A)发生共价取代制备了盐酸克伦特罗包被抗原(OV A-CL)，并以正交实验确定了共价取代反应的关键影响因素，进一步采用单因素实验确定了反应所需的最佳条件，并通过紫外扫描对制得的包被抗原进行了鉴定。
结果表明，投料比例是盐酸克伦特罗完全抗原合成的关键因素，搅拌转速和反应时间也起着至关重要的作用。
而且偶联反应在1 h内基本完成，延长反应时间对提高产物偶联比影响不大。
当投料比例为30:1，pH值约为8，低速搅拌状况下，包被抗原和免疫抗原的偶联比分别高达29:1和48:1，盐酸克伦特罗完全抗原合成条件的优化筛选取得了预期的效果。
关键词：盐酸克伦特罗；重氮化反应；完全抗原；偶联比中图分类号：O625.14 文献标识码：ASynthesis of Clenbuterol Hydrochloride Complete Antigen and Optimization of itsConjugation ConditionsYANG Xiang-yu, HUANG He(Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Department of Biochemical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)Abstract: In order to synthesize the immunogen and coatigen used for the rapid immunoassay, the diazotization was adopted to prepare the Clenbuterol hydrochloride (CL) complete antigen. During which, the CL was firstly activated under strongly acidic conditions, and the activated CL was then conjugated with ovalbumin (OV A) to form coatigen OV A-CL. The important factors affecting the conjugating reaction were determined by orthogonal experiments, and the optimum value of those important factors was confirmed by single factor experiments. The prepared OV A-CL was characterized by UV scan. It was found that the CL/OV A dropping proportion is the key factor for preparing the complete antigen, while the stirring speed and reaction time are important too. The conjugating reaction can be completed within one hour and prolonging the reaction time has little effect on the increase of coupling ratio. When the CL/OV A dropping proportion (molar ratio) is 30:1, the pH value is 8 and at a low stirring dispersion speed (<250 r⋅min−1), the coupling ratio of coatigen and immunogen can be up to 29:1 and 48:1, respectively. It indicates that the optimization of the conjugation conditions of Clenbuterol hydrochloride complete antigen achieves the expected results.Key words: Clenbuterol hydrochloride; diazotization; complete antigen; coupling ratio1前言盐酸克伦特罗是一种β2-肾上腺受体激动剂 [1]。
盐酸克伦特罗的酶联免疫分析试剂盒的研制Ⅰ克伦特罗人工抗原及抗体的制备（pdfX页）
１２４虫旦里尘焦壁垒查！坚生！旦蔓！！堂筮ｌ塑坠血！！型垡丛堂坐！生！！盟！型坠！些！ｇ吐ＺＱ鲤．旦尘世！盟．１１：＿生】【检测技术】［文章编号］１００４－８６８５（２００４）０１．１２４－０３盐酸克伦特罗的酶联免疫分析试剂盒的研制一Ｉ克伦特罗人工抗原及抗体的制备李利东１，宓晓黎１，袁建兴１，潘荣生２（１江苏省微生物研究所，无锡２１４０６３；２．镇江出入境检验榆疫局，江苏２１２００８）摘要［目的］酶联免疫分析试剂盒中的关键试剂是制备ＣＢＬ人工抗原和抗体。
［方法］通过重氮偶联法制备克伦特罗人工抗原．不删摩尔比的克伦特罗一牛血清白蛋白结合物免疫家兔。
［结果］经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一７５柱纯化，用薄层层析和紫外光谱确证．获克伦特罗一牛血清白蛋白结合物，间接酶联免疫分析法测试其效价Ｎ／Ｐ＞ｌ：４０９６００。
［结论］重氮偶联法成功制备ＣＢＬ—ＢＳＡ．并获得高效价的抗血清。
关键词觅伦特罗；人工抗原；抗体；制备Ｓｔｕｄｙ∞¨ｍ２瑚一Ｉｉａｋｅｄｉｍｍｔｍｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｋｉｔｆｏｒｄｅｎｂｕｔｅｒｏｌｈｙｄｒｃｌｄｏｒｋｌｅ一一Ｉｐｒｅｌｍｒａｔｉｏｎｏｆｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌｉ’ｍｍｌｍｏ—ｇｅｎａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ“胁昭１，Ｍ１Ｘｉａｏｌｉ。
．Ｈ洲Ｍ锄‘，ｐＡＮＲｏｎｇｓｈｅｎｆ．１．Ｊｉａｎｇｓｕ埘Ⅱｍ矿Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｃｙ，Ｗｔｔｘｉ２１４【）６３；２纨啦昭Ｅｎｔｒｙ—ｅｘｉｔＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎａ＇Ｑｆａｕａ，ｔｔｉｎｅＢｕｒｅａｕｏｆＰ．Ｒ．Ｃ，Ｊｌｄ７ｗｘｕ２１０００８ＣｈｉｎａＡｋｓｌｒａｅｔＣｌｅｎｂｕ／ｅｒｅｌｉｍｍｕｎｏｇｅｎａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ”ｅｒｅｋｅｙｒｅａｇｅｎｔｓｉｎＥＬＩＳＡｋｉｔＩｎ＇ｔｔｎｔｍｏｇｅｎｗｅｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂ、ａｃｌｅｎｂｕｔｅｒａｌｄｉ—ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｃｏｕｐｌｅｄｔｏｂｏｖｉｎｅ￥ｅｎｌｌｎａｌｂｕｍｉｎａｎｄａｎｔｉｓｅｒｕｍｓｒａｉｓｅｄｉｎｒａｂｂｉｔｓｂｙｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎａ鲥ｒ日ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｒｍｌａｒｒａｔｉｏＣＢＬ—ｄｉａｚｏ—ＢＳＡＣＢＩ－一ＢＳＡｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｈｉｎ—ｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄＵＶｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＴｈｅｉｒｍｎｕｎｉｚｉｎｇｐｏｔｅｎｃｙＷａＳＮ／Ｐ＞１：４０９６００ｗｈｉｃｈｔｒｓｓａｙｈｙＥＬｋ．Ｈｉｇｈｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇｐｏｔｅｎｃｙａｎｔｉｓｅｒｕｍａｃｌｆｉｅｖｅｄｂｖｔｈｉｓｍｅｆｌｌｏｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ；ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ；ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［中图分类号］Ｒ４４６６１［文献标识码］Ａ盐酸克伦特罗（ＣＢＬ）是人上合成的肾上腺素０受体选择性激动剂．是·种支气管扩张剂．崩丁治疗动物和人的阻塞性支气管哮喘。
盐酸克伦特罗完全抗原的鉴定
盐酸克伦特罗完全抗原的鉴定陈艺宏;张琛卿;贺延志;张宏;王玉帅;李昊【摘要】为制备并鉴定盐酸克伦特罗(CLB)完全抗原CLB-BSA,采用重氮法将盐酸克伦特罗(CLB)和牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,通过SDS-PAGE凝胶电泳、紫外全波长扫描、傅里叶红外光谱法等进行鉴定,现有盐酸克伦特罗完全抗原鉴定方法未曾采用过傅里叶红外光谱法。
结果表明:本方法成功地制备了完全抗原,偶联比在9~13。
通过投料比与偶联比关系的探究,可知当CLB与BSA的投料比例小于80∶1时,偶联比随着投料比例的增加而升高,但当投料比大于80∶1时,偶联比反而下降,为了节约成本,投料比应控制在80∶1以下。
【期刊名称】《生物化工》【年(卷),期】2017(000)001【总页数】5页(P5-9)【关键词】盐酸克伦特罗;完全抗原;制备;鉴定;偶联比【作者】陈艺宏;张琛卿;贺延志;张宏;王玉帅;李昊【作者单位】福州大学生物科学与工程学院;福州大学生物科学与工程学院;福州大学生物科学与工程学院;福州大学生物科学与工程学院;福州大学生物科学与工程学院;福州大学生物科学与工程学院【正文语种】中文【中图分类】S859.84盐酸克仑特罗（Clenbuterol Hydrochloride，CLB）是一种β2-兴奋剂，也称为β2-肾上腺素受体激动剂。
其与肾上腺素有着相同的药效作用，主要用于支气管哮喘、支气管痉挛和阻塞性肺炎等疾病的治疗。
由于CLB有营养重新分配的效应，在1980年代初，一家美国公司开始在饲料中添加该物质。
CLB能显著提高瘦肉的转化率，因此，β2-肾上腺素受体激动剂也被称为“瘦肉精”。
若人食用了含CLB 的食物，在很长一段时间之后，可能会出现头痛、胸闷、恶心等症状[1]。
2007-2014年，由瘦肉精引起的食物中毒事件多达52起以上，主要集中于广东、浙江、福建、湖南四省。
瘦肉精中毒的食物来源主要是猪肉和猪内脏，最高添加量达到了280mg/kg[2]。
盐酸克伦特罗检测方法的研究进展获奖科研报告论文
盐酸克伦特罗检测方法的研究进展获奖科研报告论文摘要: 近年来, 食品安全受到社会高度重视, 盐酸克伦特罗在临床上用于支气管扩张, 可用于临床哮喘治疗, 支气管炎症治疗等, 属于肾上腺素兴奋剂。
在动物饲料中加入该物质能够提高瘦肉率, 因此很多不法商家利用该物质提高肉畜的品质, 然而残留于动物体内的该物质会导致食用人群出现不同程度的中毒, 甚至会出现中毒死亡。
目前, 国内外针对盐酸克伦特罗的含量研究, 包括高效液相色谱法, 气质联用, 气相色谱法, 酶联免疫测定法等多种方法。
在本次研究中我们针对近几年常用的检测方法对该物质进行方法检测研究。
关键字：盐酸克伦特罗;检测;方法;进展近年来, 随着社会经济建设的发展使得畜牧业也得到了相应的发展, 在生产过程中由于非法添加药物而导致兽药残留问题严重, 而兽药残留会严重危害到人们的身体健康, 因此人们高度重视食品安全问题。
在畜牧业中过量使用盐酸克伦特罗能够提高饲料转化率、提高瘦肉率, 但该物质属于兴奋类药物, 如果长期服用该药物可能会使人体出现头晕、四肢麻木、恶心等症状, 甚至危及生命。
因此, 我国明文规定畜牧业养殖不允许采用此物质, 但很多商家为牟取非法利益, 过量使用该物质导致消费者出现中毒的现象, 因此有必要针对盐酸克伦特罗的残留量进行检测分析, 在本次研究中我们针对几种检测方法进行比较, 能够对今后发展进行展望。
一、盐酸克伦特罗性质分析首先该物质是属于肾上腺素的激动剂, 也被称为是瘦肉精。
从药学上认为是双氯醇胺, 分子量為313.65, 在常温状态下是白色或微黄色的粉末状结构, 无臭, 味苦, 极易溶于水、乙醇、甲醇、微溶于丙酮、氯仿、不溶于苯。
其化学性质活泼, 可通过多种化学反应形成化合物。
二、检测方法当前针对该物质的检测方法包括生物、理化以及免疫学检测, 其中理化检测中包括高效液相分析、气质联用、毛细管电泳法;免疫学检测包括酶联免疫、滴金免疫层析、免疫荧光检测、放射性免疫等。
盐酸克伦特罗酶标抗原的制备及鉴定
盐酸克伦特罗酶标抗原的制备及鉴定黄晨;吴冬雪;王禹;张俊哲;柴铭骏;董志珍;赵祥平【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2015(000)006【摘要】选取辣根过氧化物为抗原标记酶，采用重氮化法将盐酸克伦特罗CLEN 分别与牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联，合成包被抗原和免疫原，并通过紫外光谱扫描（UV）、SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳法验证偶联成功。
这为下一步获得针对盐酸克伦特罗类特异性单克隆抗体制备及其相应食品安全检测试剂盒开发奠定了基础。
【总页数】4页(P97-100)【作者】黄晨;吴冬雪;王禹;张俊哲;柴铭骏;董志珍;赵祥平【作者单位】天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461;天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津300461【正文语种】中文【相关文献】1.盐酸克伦特罗酶标抗原的制备及其ELISA检测 [J], 陈曦;曹慧;徐斐;李红梅;于劲松2.Eu3+标抗原盐酸克伦特罗的时间分辨荧光免疫检测 [J], 樊晓博;杨金易;高秀杰;吴英松;孙远明;雷红涛3.盐酸克伦特罗人工抗原的制备与鉴定 [J], 周景明;段倩倩;祁艳华;栗宁;郑伟;王新洲;陈菲;王爱萍4.盐酸克伦特罗完全抗原的鉴定 [J], 陈艺宏;张琛卿;贺延志;张宏;王玉帅;李昊5.盐酸克伦特罗的酶联免疫分析试剂盒的研制—Ⅰ克伦特罗人工抗原及抗体的制备[J], 李利东;宓晓黎;袁建兴;潘荣生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
盐酸克伦特罗快速检测方法的研究进展
盐酸克伦特罗快速检测方法的研究进展程 政（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳４７１０００）中图分类号：Ｓ８１６．７９ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００５－７３０７（２０２３）０４－００１１－００４ 盐酸克伦特罗（ＣＬＢ）作为一种β受体激动剂类药物，多用于临床，又因其具有促进畜禽生长、提高畜禽瘦肉率等作用而用于畜禽养殖。
人食用后易造成心悸、心慌、胸闷、心律失常等并发症，因此国内外多数国家已严禁使用，我国也明令禁止在饲料中添加。
盐酸克伦特罗作为一种能在短期内迅速提升畜禽瘦肉率的肾上腺素类药物，其有效快速的检测手段一直被学者广为研究。
吕睿研究出利用混合铱／硅纳米线基质，可将质谱信号提高１０倍，灵敏检测克伦特罗和其他小分子。
刘文光建立了包括克伦特罗在内的１６种β 受体激动剂类药物在猪、牛、羊毛发及尿液中的超高效液相色谱串联质谱的多残留检测方法。
周珊珊通过ＥＬＩＳＡ方法检测猪尿中克伦特罗残留量，分析此方法定性检出限为０．１４７μｇ／Ｌ，定量检出限为０．４９０μｇ／Ｌ。
马璐瑶开发了一种基于微流纸的酶联免疫吸附测定牛奶中的盐酸克伦特罗含量，检测极限为０．２μｇ／Ｌ。
张雪娇则研究了山羊体内盐酸克伦特罗的检测靶标，结果表明肝脏和尿液更为适合作残留检测靶标。
而近期更有研究发现使用硼碳氧氮化物（ＢＣＮＯ）纳米片作为传感介质用于电化学检测猪血清和药片中盐酸克伦特罗有良好的稳定性和分析性，该传感器有１７ｎｇ的低检测限，为盐酸克伦特罗的检测提供了新策略。
结合近年来相关的快速检测方法，如色谱法、传感器分析法、免疫分析法为盐酸克伦特罗新型检测技术提供新的思路和参考，将检测条件优化、检测效率提高，为食品及其他类别中盐酸克伦特罗残留量做出更精准的测定。
１ 快速检测盐酸克伦特罗的方法１．１ 色谱法１．１．１ 液相色谱 质谱联用法 盐酸克伦特罗测定的国家标准《动物源性食品中多重β 受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》曾于２００８年出台，并将于２０２３年２月１日废止。
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2009 年 4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr. 2009文章编号：1003-9015(2009)02-0355-05盐酸克伦特罗完全抗原的合成及其偶联工艺的优化杨香瑜, 黄鹤(天津大学化工学院生物化工系系统生物工程教育部重点实验室, 天津 300072)摘要：为获取用于快速免疫分析的免疫抗原和包被抗原，本实验采用重氮化反应制备盐酸克伦特罗(Clenbuterolhydrochloride, CL)完全抗原，在强酸条件下CL先经重氮化，再与鸡卵清白蛋白(OV A)发生共价取代制备了盐酸克伦特罗包被抗原(OV A-CL)，并以正交实验确定了共价取代反应的关键影响因素，进一步采用单因素实验确定了反应所需的最佳条件，并通过紫外扫描对制得的包被抗原进行了鉴定。
结果表明，投料比例是盐酸克伦特罗完全抗原合成的关键因素，搅拌转速和反应时间也起着至关重要的作用。
而且偶联反应在1 h内基本完成，延长反应时间对提高产物偶联比影响不大。
当投料比例为30:1，pH值约为8，低速搅拌状况下，包被抗原和免疫抗原的偶联比分别高达29:1和48:1，盐酸克伦特罗完全抗原合成条件的优化筛选取得了预期的效果。
关键词：盐酸克伦特罗；重氮化反应；完全抗原；偶联比中图分类号：O625.14 文献标识码：ASynthesis of Clenbuterol Hydrochloride Complete Antigen and Optimization of itsConjugation ConditionsYANG Xiang-yu, HUANG He(Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Department of Biochemical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)Abstract: In order to synthesize the immunogen and coatigen used for the rapid immunoassay, the diazotization was adopted to prepare the Clenbuterol hydrochloride (CL) complete antigen. During which, the CL was firstly activated under strongly acidic conditions, and the activated CL was then conjugated with ovalbumin (OV A) to form coatigen OV A-CL. The important factors affecting the conjugating reaction were determined by orthogonal experiments, and the optimum value of those important factors was confirmed by single factor experiments. The prepared OV A-CL was characterized by UV scan. It was found that the CL/OV A dropping proportion is the key factor for preparing the complete antigen, while the stirring speed and reaction time are important too. The conjugating reaction can be completed within one hour and prolonging the reaction time has little effect on the increase of coupling ratio. When the CL/OV A dropping proportion (molar ratio) is 30:1, the pH value is 8 and at a low stirring dispersion speed (<250 r⋅min−1), the coupling ratio of coatigen and immunogen can be up to 29:1 and 48:1, respectively. It indicates that the optimization of the conjugation conditions of Clenbuterol hydrochloride complete antigen achieves the expected results.Key words: Clenbuterol hydrochloride; diazotization; complete antigen; coupling ratio1前言盐酸克伦特罗是一种β2-肾上腺受体激动剂 [1]。
大量用其作为饲料添加剂，可显著提高畜禽生长速率，瘦肉相对增加[2]。
但该药易在牲畜体内沉积，人食用含有该药残留的动物产品后可引起食物中毒，严重收稿日期：2008-01-29；修订日期：2008-06-02。
基金项目：天津市自然科学基金资助项目(06YFJMJC13200)。
作者简介：杨香瑜(1983-)，女，河北省沧州人，天津大学硕士生。
通讯联系人：黄鹤，E-mail：huang@者导致死亡[3~5]。
为此，各国禁止盐酸克伦特罗用作牲畜的饲料添加剂。
在食品安全检测领域，盐酸克伦特罗传统的仪器分析方法由于操作复杂、技术水平要求高限制了其广泛应用。
而免疫分析技术因其操作简便快捷，特异性强，易于现场检测等优点，具有很大的实际应用价值[6]。
实现高质量免疫分析检测的技术关键在于获得特异性好，亲和性强的盐酸克伦特罗单克隆或多克隆抗体，而由于盐酸克伦特罗的分子量较小，不具有免疫原性，必须与大分子载体蛋白偶联后才能借助大分子的T 细胞表位刺激免疫动物机体产生抗体[7]。
因此必须制备出具有高偶联比，高免疫原性的完全抗原。
目前，已报道的盐酸克伦特罗完全抗原的合成主要采用重氮化反应(反应式如图1所示)，但是并没有形成一套系统成型的工艺，合成产物的偶联比均较低[8,9]。
本实验采用重氮化反应，运用正交试验确定了最佳实验条件，并进一步采用紫外光谱扫描加以验证，结果显示完全抗原的偶联比较以往文献报道有很大的提高，该实验工作为下一步免疫实验提供了可靠的免疫抗原，同时为同类化学物质的免疫分析检测技术奠定了基础。
2 实 验2.1 试剂与仪器试剂：盐酸克伦特罗(CL)(武汉远城科技有限公司)；鸡卵清白蛋白(OVA)(华生生物有限公司)；亚硝酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钠(上海精化科技研究所)；磷酸氢二钠(上海精化科技研究所)；盐酸(天津市北方天医化学试剂厂)；氢氧化钠(天津市北方天医化学试剂厂)。
仪器：Sartoriµs 精密电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；UV-7502 PCS 紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；“NIGER” RCT-A 磁力搅拌器(杭州利加电器有限公司)；“雷磁”PHS-25数显pH 计(上海精密科学仪器有限公司)；Aqµapro 艾科浦微量有机分析专用超纯水机(重庆颐洋企业发展有限公司)；透析袋(10000)及其他常用玻璃仪器。
2.2 实验方法2.2.1 盐酸克伦特罗的活化取3 mg CL ，加入1 mL 1 mol ⋅L −1 HCL 和500 μL 蒸馏水于反应烧杯中，同时调节pH 约等于0.5，然后在4℃下往其中连续缓慢加入60 μL 0.2 mol ⋅L −1NaNO 2, 4℃低速搅拌1 h 。
2.2.2 盐酸克伦特罗与蛋白质的偶联按表1完成正交实验，将不同质量的OVA 溶于磷酸盐缓冲液中。
边搅拌边将活化的CL 缓慢加入其中，滴加过程中用1 mol ⋅L −1 NaOH 调节各pH 值维持恒定,滴加完成后，将反应体系置于4℃下，调节转速进行反应，按规定时间结束实验，将偶联反应后的反应液于4℃下，0.01 mol ⋅L −1 pH=7的磷酸盐缓冲液中透析3 d ，转入容器中静止4 h 后离心，取上清液适当稀释后进行紫外图谱扫描，结果不再发生变化，证明反应液透析完全。
2.2.3 偶联物的鉴定配置适当浓度的CL 溶液(0.25 mg ⋅mL −1)和载体蛋白溶液(0.5 mg ⋅mL −1)，分别对CL 、载体蛋白和偶联物溶液进行紫外扫描，根据紫外吸收图谱的变化可定性确定CL 和OVA 是否已经偶联成功。
H 3CC NHCH 3CH 3CH 2CH OHClNH 2ClNaNO 2HClH 3CC NHCH 3CH 3CH 2CH OHClNClNClProteinH 3CC NHCH 3CH 3CH 2CH OHClNClNProtein图1 完全抗原合成的反应式Fig.1 The reaction formula for synthesis of complete antigen表1 正交实验表L 16(44)设计Table 1 Orthogonal L 16(44)design of the testLevelsDropping proportion (molar ratio) pHStirring dispersion speed / r ⋅min −1 Reaction time/ hⅠ 20:1 7 0 0 Ⅱ 30:1 7.5150 1 Ⅲ 40:1 8 300 7 Ⅳ 50:1 8.5600 10第23卷第2期 杨香瑜等： 盐酸克伦特罗完全抗原的合成及其偶联工艺的优化 3572.2.4 偶联比例的计算将偶联物稀释10倍后，测其280 nm 和260 nm 波长下的分光光度值，按如下公式C protein (mg ⋅mL −1) =(1.45OD 280 nm −0.74 OD 260 nm )×10[10]，计算偶联产物中蛋白质浓度。
假设产物的偶联比例为n ，以偶联物溶液中1分子蛋白为基准，根据光路叠加原理：OD 280 CL +OD 280O VA =OD 280OVA-CL ，并由朗伯-比尔定律OD =εCL (ε为摩尔吸光系数，OD 为吸光值，C 为物质量浓度，L 为光程)，将该定律公式代入上式中可得，ε280 CL nC protein (摩尔浓度)L +ε280 OVA C protein L =ε280 OVA-CL C protein L ，即ε280 CL n +ε280 OVA =ε280 OVA-CL ，根据测出的CL 和OVA 的OD 280 nm 计算各自的摩尔吸光系数，而ε280 OVA-CL =OD 280 OVA-CL /[C protein /(45000+n ×313.7)]，通过以上几式，可确定偶联比例n =280OVA CL protein 280OVA protein 280CL CL 280OVA CL protein45000313.7OD C OD C OD C OD C −−−×− ////3 结果与讨论3.1 偶联产物的鉴定偶联产物的紫外图谱扫描如图2所示，CL 在296nm 处有最高吸收峰，在310 nm 附近存在一个肩峰，OVA 最高吸收峰在279 nm 处，两者在325 nm 之后吸光强度都很弱，而偶联后的完全抗原的最高吸收峰移到269 nm 处，原来CL 的296 nm 处吸收峰已经消失，但是可能由于重氮化反应过程中存在副反应产生了其他物质致使偶联后产物在325 nm 后仍有较高的吸收值。