BSA蛋白偶联多肽技术
BSA蛋白偶联多肽技术
1．1．1多肽合成按照多肽合成常规操作，合成来源于上海楚肽生物科技有限公司（Apeptide CO.,Ltd.) HPLC检测纯度为95%。
多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接于偶联剂上。
1．1．2 合成多肽与载体的偶联载体蛋白选择BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）连接法将合成的多肽与BSA进行偶联：4.6mgSPDP溶解于740ulDMSO，终浓度为20mM。
0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h。
HiTrap TM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。
4mg多肽加入偶联好的BSA-SPDP体系中室温过夜。
1．1．3 抗多肽抗体的制备选体重1. 5～2 kg的健康雄性新西兰大白兔，按常规操作卡介苗活化其免疫系统。
将偶联的BSA-多肽过滤除菌，100mg（2ml）加等体积的不完全佐剂，充分混悬。
在新西兰大白兔背部多点皮下注射，4周后加强免疫，其后每隔2周进行1次加强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次后，检测效价。
耳源静脉采血、分离血清。
1．1．4 多肽抗体的纯化Protein G柱分离纯化IgG抗体：PBSpH7.4平衡Protein G亲和柱，以0.1M Gly-HCl pH3.0洗脱，PBSpH7.4透析，分装，-20℃保存。
1mM预冷的HCl充分膨胀Sepharose 4FF（GE公司）后，15个体积的1mMHCl清洗去残留的蔗糖，每次清洗2min。
偶联缓冲液0.1MNaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl平衡2次。
多肽溶于偶联缓冲液，调节pH值到pH8.3后，加入凝胶，室温混旋3h。
加入1M预冷的乙醇胺混旋2h阻断未偶联上的活化位点。
50mM Tris-HCl pH8.0，1MNaCl 溶液与50mM Gly-HCl pH3.5，1M NaCl 交替清洗8次。
PBS缓冲液平衡10倍体积。
装柱，平衡，上样后以0.1MGly-HCl pH2.2洗脱，PBS透析，分装，-20℃冻存。
bsa制备工艺
bsa制备工艺BSA制备工艺是一种常用的制备生物传感器的方法，它能够有效地固定蛋白质或酶在固体载体上，以实现对目标物质的检测。
BSA，即牛血清白蛋白，是一种常用的载体蛋白，具有良好的生物相容性和稳定性。
BSA制备工艺的第一步是准备载体材料。
常见的载体材料有玻璃片、金属片和纳米材料等。
在选择载体材料时，需要考虑到其表面性质和化学活性，以便与BSA蛋白质相互作用。
在选择过程中，我们可以根据不同的实验需求和检测对象来进行选择。
接下来，我们需要对载体材料进行表面处理。
这一步的目的是增加载体表面的活性位点，以便与BSA蛋白质发生化学反应。
常见的表面处理方法有活化、修饰和交联等。
通过这些处理，可以增加载体表面的化学反应性，提高BSA与载体的结合效率和稳定性。
在表面处理完成后，我们需要将BSA溶液加到载体上，进行BSA的固定。
固定的方式有物理吸附和化学结合两种。
物理吸附是通过静电吸附力或疏水作用将BSA吸附在载体表面。
化学结合则是通过共价键或配位键将BSA与载体表面结合，使其更加牢固和稳定。
固定完成后，还需要进行后续的处理步骤，以确保BSA的活性和稳定性。
这些处理步骤包括洗涤、去除未固定的BSA和表面修饰等。
通过这些处理步骤，可以去除无效的BSA，提高固定的效率和稳定性。
我们需要对已制备好的生物传感器进行性能测试。
这些测试包括灵敏度、选择性、稳定性和重现性等。
通过这些测试，可以评估BSA 制备工艺的质量和性能，为后续的应用提供有效的支持。
总结一下，BSA制备工艺是一种常用的制备生物传感器的方法。
通过选择适合的载体材料和表面处理方法，将BSA固定在载体上，可以得到具有良好性能和稳定性的生物传感器。
这种制备工艺在生物医学、环境监测和食品安全等领域都具有重要的应用价值。
希望通过本文的介绍，读者能够对BSA制备工艺有一个更深入的了解。
关于BSA封闭液的使用方法大讨论
A、请问各位高手,在进行免疫荧光的实验时,浸一抗之前,要用的封闭液中1%的BSA是怎么配制? 封闭液封闭后还用PBS 清洗干净再浸一抗吗?1.可以直接用0.02M的PBS 配制2.不用PBS 清洗干净，直接浸一抗。
B、各位高手，间接法中我想摸索封闭液BSA的最佳浓度，用抗原包被后，用不同浓度的BSA(0.5%，1%，2%，3%)封闭，其他条件固定，测得OD450nm后，可以看出随着BSA浓度增高，空白值降低，待测样品的OD450nm值也降低，，应该如何确定BSA的最佳浓度?Q1、你的BSA 浓度是否太高?最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的BSA，封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。
并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。
一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。
特别是用单抗腹水直接包被，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。
但在间接法测定中，封闭一般是不可少的Q2、判断封闭条件，要考虑在此条件下是否能达到试验要求，即棋盘滴定要满足：阳性样品OD=0.8、阴性样品OD<=0.1，而不是看你待测样品OD变化趋势;过低封闭浓度势必造成本底过高，但过高又会使灵敏度降低，因此只要选择能够满足你试验要求的最低BSA浓度就可以了。
另外提醒，洗涤一定要彻底，很重要的。
Q3、包被后封闭前一般要洗涤一遍，以便于洗掉结合不牢固的包被物，防止在实验中影响实验结果;封闭后一定不要洗涤，封闭的目的就是要靠蛋白填补未被包被物占领的空间，另外封闭液一般也具有保护作用。
C、新生牛血清(细胞培养时候加到1640的那一种)可以么，用多大的浓度配比较好啊，是用双蒸水配吗??Q1、5%，TBS配，BSA是牛血清蛋白，粉剂，不是牛血清哦Q2、如果不是用biotin-avidin系统的话，用5%脱脂奶粉做封闭液就可以了，廉价，效果也很好。
BSA_PLGA微球的制备条件优化及不同添加剂对包封率的影响
26卷6期2007年12月中 国 生 物 医 学 工 程 学 报Chinese Journal o f Biomedical Engineering V ol.26 N o.6December 2007收稿日期:2005211201,修回日期:2007201215。
基金项目:天津市重点项目(043803011);国家自然基金资助项目(50473059);博士点基金(20030023004)。
3通讯作者。
E 2mail :s ongcx @BSA 2PL GA 微球的制备条件优化及不同添加剂对包封率的影响谷海刚1,2 金 旭1 龙大宏2 杨 菁1 王 海1 宋存先131(中国医学科学院中国协和医科大学生物医学工程研究所,天津市生物医学材料重点实验室,天津 300192)2(广州医学院组织胚胎学教研室,广州 510182)摘 要:目的 探讨不同优化条件及添加剂对BS A 2P LG A 微球包封率的影响。
方法 采用水Π油Π水(W1ΠO ΠW2)的双乳化技术制备了BS A 2P LG A 微球,对影响其包封率的工艺进行了研究并考察了蔗糖、聚乙二醇和甘油对包封率的影响。
结果 采用优化条件制备的微球包封率为8911%;BS A 溶液中加入添加剂后,包封率可以提高到9715%。
结论 采用水Π油Π水(W1ΠO ΠW2)的双乳化制备的BS A 2P LG A 微球可用于运载生物大分子药物,同时,提高内水相的粘度能够提高蛋白的包封率。
关键词:聚乳酸2聚乙二醇酸;牛血清白蛋白;微球E ffect of Formalution P arameters and Additives on BSAE ncapsulation Yields in P L G A MicrospheresG u Hai 2G ang 1,2 Jin Xu 1 Long Da 2H ong 2 Y ang Jing 1 W ang Hai 1 S ong Cun 2X ian 131(K ey Laboratory o f Biomedical Materials o f Tianjin ,Institute o f Biomedical Engineering ,Chinese Academy o f MedicalSciences &P eking Union Medical College ,Tianjin 300192)2(Department o f H istoembryology ,Guangzhou Medical College ,Guangzhou 510182)Abstract :Objective T o study the effect of some formalution parameters and additives on BS A encapsulation efficiency in P LG A m icrospheres.Methods BS A 2P LG A m icrospheres were prepared by double emulsion (W 1ΠO ΠW 2)method.The factors that affect the encapsulation efficiency of BS A in m icrospheres were determ ined and optim ized.M oreover ,the effects of sucrose ,PEG,and glycerol on BS A encapsulation efficiency were investigated.R esults The BS A encapsulation efficiency in P LG A m icrospheres made by optim ized technology was 8911%.The encapsulation efficiency was further increased to 9715%with adding sucrose ,PEG,and glycerol in BS A solution.Conclusions The P LG A m icrospheres made by (W 1ΠO ΠW 2)method could be served as carrires for the delivery of biopharmaceutical macrom olecular drugs.Increasing the viscosity of internal aqueous phase im proved entrapment efficiency of BS A 2P LG A m icrospheres.K ey w ords :poly (lactic 2co 2glycolic acid )(P LG A );bovine serum album in (BS A );m icrospheres中图分类号 R318108 文献标识码 A 文章编号025828021(2007)0620931205引言 现代生物技术使大规模生产高纯度的重组蛋白或多肽类物质成为可能,这些药物为疾病的预防及治疗提供了广阔的前景。
16多肽与载体偶联——三种不同介导方式
一、Frdbio –SH介导多肽与载体偶联1. cKLH载体蛋白与sulfo-SMCC的偶联（以偶联20mg多肽为例，根据实验实际偶联量，所有试剂体积作同比缩放）1.1 称取20mg cKLH（Frdbio，Cat No.: BCJ0002），溶于2ml超纯水，配成【10 mg/ml cKLH溶液】。
1.2 称取10 mg Sulfo-SMCC(Frdbio)于2ml超纯水配成【5mg/ml Sulfo-SMCC溶液】。
1.3 将以上两种溶液等体积混匀，室温(25℃)反应60 min或者37℃反应30 min，磁力搅拌器慢速均匀搅动反应，避免产生气泡。
1.4 反应完后将以上反应溶液装入10kD透析袋，在PBS（pH7.2）溶液中透析除去过多Sulfo-SMCC，每隔3h换液，至少换3～4次，确保透析完全，即为【活化的cKLH载体】（有条件的也可以用sephdex-G25分子筛色谱分离或超滤管。
活化的cKLH要尽快使用，不可久放。
）2. 多肽的偶联偶联前需检测多肽中-SH活性。
2.1 Ellman试剂法检测多肽-SH状态:方法：在96孔酶标板中，10μl多肽+100μl Ellman试剂，用分光光度计在96孔酶标板中412nm进行测量，OD ＞0.15时，多肽SH正常，如果OD＜0.15，说明多肽被氧化或者自我交联，不可使用。
偶联完成之后，透析前用上述同样方法检测DO＜0.03时，说明多肽已经80%以上全部偶联，可继续添加多肽；如果OD＞0.03，说明多肽过量未全部偶联。
如果没有Nano分光光度计，直接观察颜色，颜色变黄，说明游离—SH过量。
2.2 称取20mg多肽溶解于5ml交联缓冲液(0.1M PB，0.15M NaCl)中，配成【4mg/ml的多肽溶液】（对于难溶肽，可用≤30%的DMSO溶解），一般我们只偶联5～10mg多肽，等比例缩小体积即可。
2.3 将第1.4步透析好的cKLH与第5步配好的【4mg/ml多肽溶液】混合，室温(25℃)4h。
壳聚糖修饰的PLGA纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究
２．２纳米粒的制备
采用改良溶剂挥发法制备纳米粒…］：将２０ｍｇ ＢＳＡ溶于０．５ｍＬ磷酸盐缓冲液（ｐＨ值为７．２）中，转 入ＰＬＧＡ的二氯甲烷溶液中，超声形成初乳，将初乳
转入２０ｍＬ １％ＰＶＡ溶液中，再次超声形成复乳，搅拌
４ｈ，待有机溶剂挥发后１８，０００ｒ／ｍｉｎ离心收集纳米粒， 冷冻干燥即得ＰＬＧＡ
ＮＰ。
２．２．１吸附法修饰纳米粒 根据前期的研究工作【１１。，在上述制备ＰＩ，ＧＡ纳米 粒的过程中，０．５％ＰＶＡ水溶液中含１００ｍｇ ＣＳ醋酸 溶液，一起作为外水相。其余步骤和方法同前。 ２．２．２共价交联法修饰纳米粒 称取１００ｍｇ制备好的ＰＩ。ＧＡ ＮＰ，加入ＰＢＳ（ｐＨ ５．ｏ）中分散均匀，加入ＥＤＣ活化纳米粒表面的羧基， 然后加入１００ｍｇ ＣＳ，室温搅拌反应２４ｈ，离心收集纳
米粒。
＊基金项目：国家重大科学研究计划资助项目（２００６ＣＢ９３３３００）；新乡医学院省级重点学科开放课题资助项目（ＺＤ２００９４４）
收到初稿Ｅｔ期：２０ｌｏ—０４—２２ 收到修改稿日期：２０１０ １２—１４ 通讯作者：陈红咐，张其清
作者简介：陈红丽（１９７８一），女，河南安阳人，博士，讲师。师承张其清教授，从事生物医用材料和纳米药物载体的研究。
构成及键台状卷等＾面的信息，ＰＬＧＡ ＮＰ表面来十龟 测到氨元素信号，面ＡＤＣＳＮＰ及ＣＢＣＳ ＮＰ均检测到 氟元素的信号（罔２）。由于所用材料中只有ＣＳ含有
万方数据
助
锨
材
料
２０ｌ １年第２期（４２）卷
表１纳米粒性质表征
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ 纳米粒
壳聚糖cs是自然界存在唯一带正电荷的天然多糖具有良好的生物相容性可生物降解性和组织黏附性被用作化学药物抗体蛋白多肽及基因类药物的载体710本文以plga为载体材料以牛血清白蛋白bsa为多肽蛋白质模型药物采用溶剂挥发法制备了plga纳米粒选择cs分别采用直接吸附法修饰纳米粒adcsnp以及共价联接法修饰纳米cbcsnp粒表面对纳米粒的理化性质及bsa的包封率释药性质等进行了考察对两种方法修饰的纳米粒中bsa的构型变化比较研究为不同修饰方式制备的纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究提供了参考依21主要原料与仪器plga末端未封端mw为105050山东省医疗器械研究所壳聚糖低分子量脱乙酰度85sigma牛血清白蛋白6300065000北京鼎国生物有限公司bca白检测试剂盒pierce其余试剂均为分析纯
质谱牛血清蛋白bsa酶解特征肽段
质谱牛血清蛋白bsa酶解特征肽段质谱（Mass Spectrometry）是一种常用于分析和鉴定复杂化合物的技术。
质谱可通过将样品中的分子转化为离子，并通过对离子的质量和电荷比进行测量，从而获得化学物质的结构信息。
质谱技术在生物医学领域被广泛应用于蛋白质的酶解和鉴定。
牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）酶解产生的特征肽段，具有重要的生物学和医学意义。
在本文中，我们将讨论BSA的酶解特征肽段，并详细介绍其在质谱分析中的应用。
BSA是一种常见的血清蛋白，在生物学研究中常被用作载体蛋白、标准蛋白以及控制蛋白。
酶解BSA可以产生一系列特定肽段，这些肽段在质谱分析中常被用作鉴定BSA及其衍生物的参考标准。
BSA的酶解可通过不同的酶以及酶解条件进行，常用的酶有胰蛋白酶（Trypsin）和胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）等。
BSA的胰蛋白酶酶解产生的特征肽段是最常见的。
胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其能够特异性地在C端剪切精氨酸或酪氨酸。
BSA经胰蛋白酶酶解后，可得到多个肽段，其中一些肽段有着较高的丰度和离子产量，使其成为质谱分析的重要目标。
BSA胰蛋白酶酶解后的特征肽段之一是Tyr-Pro-Lys-Met-Pro-Glu-His-Phe-Tyr-Lys-Arg。
这个肽段的序列是根据BSA蛋白的氨基酸序列和胰蛋白酶消化的酶切位点推导出来的。
此外，这个肽段还具有一定的生物活性和结构特征，可以用于BSA的定量分析。
除了胰蛋白酶外，胰凝乳蛋白酶也经常用于BSA的酶解。
胰凝乳蛋白酶是一种非特异性蛋白酶，可以在多个氨基酸残基上切割，产生多个肽段。
胰凝乳蛋白酶酶解后的BSA肽段与胰蛋白酶酶解产生的肽段存在差异，其特征肽段的序列和质谱性能也不同。
BSA的酶解特征肽段在质谱分析中具有重要的应用。
通过质谱仪器的高灵敏度和高分辨率，可以对特征肽段的质量和电荷进行准确测定。
结合数据库中的氨基酸序列和肽段质谱数据，可以准确地鉴定和定量特定肽段和蛋白质。
多肽偶联方案
多肽合成时, 先了解多肽的位点. 如果是炭末端多肽,直接用ALPHA氨基作为连接点. 如果是氨基末端的多肽, 得在多肽的炭末端加一个半胱氨酸(提供-SH基团)
赖氨酸Lys提供游离-NH2 天冬氨酸D 提供游离-COOH 谷氨酸E 提供游离-COOH 半胱氨酸C 提供游离-SH
标记到BSA 羧基端。
1、BSA稀释到1mg/mL（66KD，100个羧基）, 缓冲液为50mM MES（pH 6.0）+0.5M NaCl；
2、搅拌条件下，迅速加入2mM EDC（母液为：50mg/ml 0.25mol/ml）和5mM sulfo-NHS
（母液为：50mg/ml）；室温反应15min；
3、搅拌条件下，加入20mM巯基乙醇（约1/600），室温反应10min（如果蛋白对巯基乙醇
敏感，请改用脱盐柱），活化完毕；
4、目标多肽稀释到适当浓度（考虑与BSA 有效羧基的mol数成一定比例），缓冲液为
100mM PB7.5。
5、搅拌条件下，室温反应2hr；
6、透析至pbs 。
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1．1．1多肽合成
按照多肽合成常规操作，合成来源于上海楚肽生物科技有限公司（Apeptide CO.,Ltd.) HPLC检测纯度为95%。
多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基连接于偶联剂上。
1．1．2 合成多肽与载体的偶联
载体蛋白选择BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）连接法将合成的多肽与BSA进行偶联：4.6mgSPDP溶解于740ulDMSO，终浓度为20mM。
0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室温静置1h。
HiTrap TM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP。
4mg多肽加入偶联好的
BSA-SPDP体系中室温过夜。
1．1．3 抗多肽抗体的制备
选体重1. 5～2 kg的健康雄性新西兰大白兔，按常规操作卡介苗活化其免疫系统。
将偶联的BSA-多肽过滤除菌，100mg（2ml）加等体积的不完全佐剂，充分混悬。
在新西兰大白兔背部多点皮下注射，4周后加强免疫，其后每隔2周进行1次加强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次后，检测效价。
耳源静脉采血、分离血清。
1．1．4 多肽抗体的纯化
Protein G柱分离纯化IgG抗体：PBSpH7.4平衡Protein G亲和柱，以0.1M Gly-HCl pH3.0洗脱，PBSpH7.4透析，分装，-20℃保存。
1mM预冷的HCl充分膨胀Sepharose 4FF（GE公司）后，15个体积的1mMHCl清洗去残留的蔗糖，每次清洗2min。
偶联缓冲液0.1MNaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl平衡2次。
多肽溶于偶联缓冲液，调节pH值到pH8.3后，加入凝胶，室温混旋3h。
加入1M预冷的乙醇胺混旋2h阻断未偶联上的活化位点。
50mM Tris-HCl pH8.0，1MNaCl 溶液与50mM Gly-HCl pH3.5，1M NaCl 交替清洗8次。
PBS缓冲液平衡10倍体积。
装柱，平衡，上样后以0.1MGly-HCl pH2.2洗脱，PBS透析，分装，-20℃冻存。
1．1．5 免疫双扩散
在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径约5mm，孔距2mm~5mm，吸取多肽抗原悬液滴入中间孔，等倍稀释的血清分别加入外周的对称孔中。
37℃温箱中作用，于24h 后观察结果。
吸取血清滴入中间孔，等倍稀释的多肽抗原分别加入外围的对称孔中，37℃温箱中作用，于24h后观察结果。
好的设计+好的多肽质量是制备好的抗体必要条件！SPDP
中文名：3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯
英文名：N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate
分子式：C12H12N2O4S2；分子量：312.37；应用：交联氨基和巯基
外观：白色或浅黄色粉末；储存条件：0-5℃；运输条件：室温；储存条件：冷藏保存
产品描述：SPDP，一种异-双官能试剂，用于结合两种不同的蛋白质，诸如酶和抗体。
SPDP首先经由其氨基与一个蛋白质分子反应。
SPDP向该蛋白质中引入吡啶二硫基，接着该吡啶二硫基由DTT还原形成硫醇基。
这些硫醇基接着与另一蛋白质分子形成二硫键，从而产生异二聚物蛋白质。
BSA
牛血清白蛋白BSA，Bovine Serum Albumin：1、在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。
防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻
2 、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。