牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
牛病毒性腹泻病毒BVDV胶体金抗原快速检测技术
检测线（T）的红色强于背景。
检测结果为阳性的牛只，请间隔7－14天后重新采样检测，以确认持续感染牛。
阴性结果：
检测线（T）的红色与背景相同或弱于背景。
无效结果：
对照线（C）未呈现颜色
或
背景的颜色使检测结果无法判读。
请仔细阅读上述操作说明及注意事项，重新检测。
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）
胶体金抗原快速检测卡操作指南
操作步骤-示意图
操作说明
注意事项
使用前，请将待检样品及试剂盒组分回温至操作温度（10-40℃）。
试剂盒组分回温时间不少于15分钟。
检测卡在拆封后15分钟内使用。
仅适用于耳部组织样品
•请将耳部组织装入样品管
•如为小型耳组织(≥2–3 mm)加入8滴缓冲液；如为大型耳组织(≥1 cm)，加入16滴缓冲液。
吸管不能重复使用。
也可使用移液器吸取40-50ul样品。
请于加样后1分钟内向样品孔垂直滴入2滴缓冲液，开始计时。
加样后立即加入缓冲液。
缓冲液使用前摇晃数次，垂直滴加。
加液5分钟后，结果窗未见液体流动，在样品孔补加1滴缓冲液。
加入缓冲液后15-30分钟内判读结果。
15-20分钟即可判读结果。
结果判读：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
•涡旋混合。
•浸泡5分钟—3天。
仅适用于血清／血浆／全血样品
将样品彻底混匀，请勿将缓冲液加入样品。
耳组织样品充分浸泡至少5分钟，使用前混匀样品。
全血样品如已分层，直接取用上层清澈液。
请将检测卡放于平整的桌面上，并使用配套的滴管将1滴样品垂直滴入检测卡的样品孔中。
检测卡平放，“IDEXX”标识朝前。
垂直滴加样品。
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2糖蛋白表达的复制子颗粒疫苗的开发和评估
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2糖蛋白表达的复制子颗粒疫苗的开发和评估课题来源：Loy J D, Gander J, Mogler M, et al. Development and evaluation of a replicon particle vaccine expressing the E2 glycoprotein of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in cattle[J]. Virology journal, 2013, 10(1): 35.摘要背景：牛病毒性腹泻病毒全世界广泛存在、对畜牧业危害严重的牛病毒性病原体之一。
甲病毒衍生的复制子颗粒已被证明是对人和动物具有安全和高度有效的疫苗载体。
复制子颗粒不具有传播性，可以同时诱导体液和细胞介导的免疫反应。
本研究是第一个实验来证明，基于甲病毒的复制子颗粒在一个标准的加强免疫接种方案可以免疫病原体，具有很大的商业意义。
结果：牛病毒性腹泻病毒的子基因1b型的E2糖蛋白表达的复制子颗粒产生并表达被证实，可在体外使用多克隆抗体和单克隆抗体表达E2。
颗粒制成的疫苗，在Vero细胞中生成，BVDV加强免疫方案接种牛犊的两个剂量水平。
疫苗接种导致交叉中和1型和2型BVD基因型加强免疫后中和抗体滴度。
此外，高剂量的疫苗接种证明一些对临床疾病的保护，并显着降低由病毒感染引起的白细胞减少症的程度。
结论：BVDV E2糖蛋白表达的颗粒疫苗，用强免疫方案可诱发交叉中和抗体滴度，减少白细胞减少后的难题，减轻临床上疾病的牛犊。
本研究保证BVDV E2糖蛋白表达的颗粒疫苗为一种安全和有效的BVDV疫苗。
关键词：BVD，牛病毒性腹泻病毒，病毒复制，复制子颗粒疫苗1 调查结果1.1 背景资料牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是一种有包膜的，正链RNA病毒中的瘟病毒属（黄病毒科），的病原体。
BVD是在世界上经济上危害严重的牛的疾病之一。
第2节牛病毒性腹泻粘膜病
3.传播途径 本病主要通过消化道、呼吸道感染，另外 也可通过胎盘发生垂直感染。 4.流行特点 新疫区的牛发病率约5％，其致死率多达 90～100％，而老疫区发病很少，多数为隐性 感染。
牛病毒性腹泻-黏膜病
(Bovine viral diarrhea-Mucosal Disease； BVD-MD)
一、概述
牛病毒性腹泻一粘膜病是由牛病毒性腹泻 病毒引起的主要发生于犊牛的一种传染病。
特征是粘膜发炎、糜烂和腹泻。本病简称 牛病毒性腹泻或牛粘膜病。
本病分布广泛，世界各地养牛地区均有 1980年以来，我国从国外引进奶牛和种牛，将 本病带人我国，并分离鉴定出了病毒 。
牛病毒性腹泻-粘膜病：病牛腹泻，脱水消瘦，衰竭死亡
牛病毒性腹泻-粘膜病：病牛鼻粘膜严重出血
五、病理变化
本病主要病变表现在消化道和淋巴组织。 鼻镜、鼻孔粘膜、齿龈、上腭、舌面两侧及 颊部粘膜有糜烂及浅溃疡，严重病例在咽、喉头 粘膜有溃疡及弥散性坏死，最有特征性的病变是 食道粘膜糜烂，大小不等呈直线性排列。 瘤胃粘膜出血、糜烂，真胃粘膜炎性水肿、 糜烂。
2.发病时采取的措施
(1)病畜隔离治疗或淘汰，治疗以对症 治疗为主， 配合使用抗菌类药物以防止继 发感染。
(2)加强消毒及其他防疫措施。
3.牛病毒性腹泻黏膜病病毒的抵抗力 本病毒对外界环境因素抵抗力不强，56℃很 快即被灭活，对脂溶剂敏感，－70℃可保存多 年。常用消毒药对本病毒有良好消毒效果。
三、流行病学
1.易感动物
本病可感染奶牛、黄牛、水牛、牦牛、绵羊、 山羊、猪、鹿及小袋鼠。以犊牛(6～18月)易感 性最高，成年牛和其它动物多为隐性感染。
猪瘟病毒E2蛋白研究进展
猪瘟病毒E2蛋白研究进展江馗语【摘要】Classical swine fever(CSF)is a highly contagious, acute, hyperthermic, multi-systemic hemorrhagic viral disease of pigs, which caused by classical swine fe-ver virus(CSFV), a member of the genus Pestivirus of the Flaviviridae. CSF is preva-lent in all continents except North America and Oceania,it is distributed worldwide, and it has relapsed in some European countries(Netherlands, Belgium, Britain, Germa-ny, Italy, Spain, etc.)which had eliminated CSF. Although we have used HCLV vaccine for inoculation for a long time,but CSF still exists in our country and happens from frequency of pandemic into erratic regional dissemination. Latent and persistent in-fection has increased. Therefore, we need clear swine fever virus genome structure and the most research value immunological antigen protein structures to provide a theoretical basis for the development of new and effective vaccines and diagnostic reagents. In this paper,we have reviewed the research progress in genomic structure of CSFV,structure, function, epitopes,expression and applications of E2 protein.%猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起的一种急性、接触性传染病。
牛病毒性腹泻病毒间接免疫荧光检测方法的建立及应用
光素Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ 标记的兔抗羊Ｉ ｇ Ｇ Ｓ ￣ 二抗 。４ ｆ Ｂ Ｖ Ｄ Ｖ 接种于ＭＤ Ｂ Ｋ－ ￣胞后 ，对方法的反应条件进行优化。结果表明Ｉ Ｆ Ａ 最优
待 ＭＤＢ Ｋ细 胞 长成 单层 ，用胰 酶 消 化后 ，将 悬 液
杰 （ １ ９ ８ ７ －），男，四川遂宁人 ，主要从事兽 用疫苗研 究。
２ （ ） １ ７ 年 第 ４ ７ 卷 ・ 第 ３ 期
１
动 物 医学
ｄ０ｎｇ Ｗ Ｕ ｙｉ ＸＵ
国
牛病 毒性 腹 泻病 毒 间接 免疫 荧 光检 测 方 法 的 建 立及 应 用
黄 杰 ，岳 丰雄 （ 成 都 天邦 生物制 品有 限公 司，四川 成都 ６ １ ０ １ ０ ０ ）
此 ，本 研 究 目的 在 于 建 立 Ｂ Ｖ Ｄ Ｖ 间接免 疫荧 光 的方法 ， 对猪瘟苗 中 Ｂ ＶＤ Ｖ 病 毒 粒 子 的 存 在 形 式 进 行 检 测 ，从
掉 胰 酶消 化 液 ， 向培养 瓶 中加入 适 量 的生 长 液 ，轻柔 吹 打 细 胞 ，使 其 成 为 单 个 细 胞 ， 然 后 再 加 入 适 量 的 生
猪瘟 病 毒 （ Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ） 、猪 伪 狂 犬病 病 毒 （ Ｐ Ｒ Ｖ） 、猪 圆环 病毒 ２ 型（ Ｐ Ｃ Ｖ ２） 、 猪繁 殖与 呼吸综 合征 病毒 （ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ） 、
ＭＤ Ｂ Ｋ 细 胞 系 ，均 南 成 都 天 邦 生 物 制 品 有 限 公 司 制 备 、 鉴 定 、保 存 。
污 染情 况仍 然 较为 严重 ， 从 而影 响猪 瘟苗 的质 量 。 因此 ，
单克隆抗体实验报告
一、实验目的1. 学习单克隆抗体的制备方法；2. 掌握单克隆抗体的鉴定技术；3. 了解单克隆抗体在免疫学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单个B细胞克隆产生的，具有高度特异性和亲和力。
单克隆抗体的制备通常采用杂交瘤技术，即将B细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既具有B细胞的抗体产生能力，又具有肿瘤细胞的无限增殖能力。
通过筛选和培养杂交瘤细胞，可以得到大量相同的单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 抗原：目的蛋白；3. 细胞株：SP2/0（小鼠骨髓瘤细胞）；4. 培养基：IMDM培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基；5. 试剂：FCS、HAT（Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine）、PEG（聚乙二醇）、兔抗小鼠IgG-HRP（辣根过氧化物酶标记）、羊抗兔IgG-FITC（荧光素异硫氰酸酯标记）；6. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 抗原免疫小鼠：将抗原注入Balb/c小鼠体内，免疫小鼠，制备抗体。
2. 细胞融合：收集免疫小鼠脾细胞，与SP2/0细胞按一定比例混合，加入PEG，诱导细胞融合。
3. 融合细胞筛选：将融合细胞接种于96孔板，加入HAT培养基，培养7-10天，观察细胞生长情况，筛选出阳性克隆。
4. 阳性克隆扩大培养：将阳性克隆扩大培养，制备杂交瘤细胞。
5. 阳性克隆抗体检测：收集杂交瘤细胞培养上清，进行ELISA检测，鉴定阳性克隆。
6. 阳性克隆抗体纯化：将阳性克隆抗体进行亲和层析或蛋白A/G层析，纯化抗体。
7. 阳性克隆抗体鉴定：采用流式细胞术或免疫荧光技术，鉴定阳性克隆抗体。
五、实验结果1. 免疫小鼠制备抗体：免疫小鼠后，血清抗体水平明显升高。
2. 细胞融合：融合细胞生长良好，阳性克隆筛选成功。
3. 阳性克隆扩大培养：阳性克隆杂交瘤细胞生长旺盛。
牛副流感病毒 3 型检测技术规范
牛副流感病毒3型检测技术规范1 范围本文件规定了牛副流感3型的临床诊断、病原分离鉴定、RT-PCR、ELISA等诊断技术要求。
本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对牛副流感病毒3型的检测。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
牛副流感病毒3型 bovine parainfluenza virus type 3, BPIV3属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒（见附录A中图A.1）。
4 临床诊断流行病学牛副流感一年四季均可发生，以秋冬、初春季多见。
各种年龄牛均可感染。
病牛和带毒牛是本病主要传染源，可经接触、呼吸道和子宫内感染，多与其它疾病混合感染。
临床症状感染牛主要临床表现为高热（体温≥41 ℃）、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液、咳嗽、喘等呼吸道症状。
病理剖解可见支气管肺炎，支气管黏膜肿胀、出血，管腔中有纤维素块，局部肺组织见灰色或红色肝样实变等。
5 实验室诊断病毒分离牛肾细胞系（MDBK 细胞系）、棉签、马血清（HBS ）、DMEM 培养基、青霉素、链霉素、细胞培养板。
5.1.25.1.1试剂耗材仪器电子天平、研磨仪、台式冷冻离心机、生物安全柜、CO 2培养箱、倒置显微镜、冰箱。
5.1.3 病料采集 5.1.3.1 鼻拭子用无菌棉签刮取鼻道分泌物，然后放入3 mL ～5 mL 含1000 IU/mL 青霉素和1000 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基的冻存管中，编号，记录，于2 ℃～8 ℃条件下保存并尽快送往实验室。
5.1.3.2 血清使用非抗凝采血管采集新鲜血液2 mL ～5 mL ，静置分离血清，编号，记录，于2 ℃～8 ℃条件下保存并尽快送往实验室。
牛病毒性腹泻病毒增殖特性研究
192021.01·试验研究 | Experimental research0 引言我国的养牛业发展迅速，目前我国已建立完整牛疫病防控体系，能够及时有效的应对牛疫病爆发，但因为我国养牛业发展不平衡，各地区情况不同，造成疫病感染病原种类差异极大，给疫病防控带来巨大困难。
为更好地建立疫病防控体系，养殖企业每年都要根据上一年度的疫病爆发情况，建立免疫程序以保证生产。
但因为我国的牲畜调运频繁，很多疫病在属地检测时因为抽检阴性和检查人员技术水平的原因，很难做到完全净化，在全国运输中会造成病毒的大规模传播，甚至造成疫病爆发。
牛病毒性腹泻普遍存在养殖业内，在犊牛和青年牛中感染率较高，严重危害我国牛业的健康发展。
BVDV 属于黄病毒科，与猪瘟病毒同属，在对其进行抗原检测时，发现牛病毒性腹泻病毒对大多数动物都易感，同时由于BVDV 常污染牛血清，而牛血清在生物制品行业有广泛应用。
因此生物制品行业涉及到细胞、胰酶、血清甚至疫苗均存在BVDV 污染的可能。
因此，控制牛病毒腹泻病毒的传染具有重要意义。
病毒性腹泻病毒具有变异性较强，种类较多，感染普遍性的特点，针对腹泻病毒的疫苗虽然起到一定的效果，但因为病毒的多样性，防控效果不好。
而我国在病毒腹泻疫苗研究起步较慢，相关疫苗只能通过进口的方式获得，造成疫苗成本较高，不能做到完全免疫[1]。
近年，随养牛业的巨大发展，牛场规模的不断扩基金项目：牛病毒性腹泻病毒的增殖特性研究（南充市科技计划项目，19YFZJ0009）作者简介：魏玲（1990-），女，四川大英人，硕士研究生，助教，从事畜牧兽医专业相关的教学工作。
通信作者：杨国淋（1989-），男，四川广元人，硕士研究生，讲师，研究方向：实验动物学。
牛病毒性腹泻病毒增殖特性研究魏玲1，梁洪1，王怀禹1，吕远蓉1，杨国淋2（1.南充职业技术学院，南充 637131；2.川北医学院，南充 637100）摘要：为研究牛的病毒性腹泻病毒（BVDV ）的增殖特性，从南充地区腹泻牛的胃内容物提取病毒样本，利用MDBK 细胞分离出毒株，通过RT-PCR 进行扩繁检测、基因序列对比和病毒试验，最终确定分离菌株为腹泻病毒。
商品化胎牛血清及猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染的检测
进行 了荧 光 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ方 法检测 ， 现 汇报如 下 。
１ 材 料 与 方 法 １ ． １ 样 品 来 源
中 国 市 场 销 售 的 ２家 进 口胎 牛 血 清 各 ２ 批 次 共
的 以发热 、 腹泻 、 急 和慢 性 黏 膜 病 及 怀 孕 母 牛 流 产
或产 死胎 、 畸胎 ， 持 续 性 感 染 与 免 疫 耐 受 为 主 要 特 征 的一种 传 染 病 ， 发病 率 高 而 死 亡 率 低 。近 年 来 ，
Ｂ ＶＤ Ｖ， 并 提 出 了灭 活 生 物 制 品 中 Ｂ ＶＤ Ｖ 的 方
１ ． ３ 核酸提取及 Ｐ Ｃ Ｒ 体 系构 建
Ｒ ＮＡ 提 取参 照 Ｑｉ ａ ｇ ｅ ｎ公 司 ＲＮｅ ａ ｓ ｙ Ｍｉ ｎ ｉ ｋ ｉ ｔ
法“ 。由于商 品血 清 常 用 于 细胞 培 养 ， 且 很 多 细 胞
列为 小牛血 清 的必 检项 目， 也 是 我 国 活 牛 进 口重 点
说 明书进 行 。Ｐ Ｃ Ｒ体系 构建 参 照 Ｌ ｉ ｆ ｅ ｔ ｅ ｃ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ公 司Ｂ ＶＤＶ荧 光 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ检 测试 剂盒说 明书进行 。
２ 结果 与分 析
２ ． １ 胎牛血 清中 Ｂ ＶＤＶ 检 测 结果
・
４ ４ ・
《 上 海 畜牧 兽 医通讯 》 Ｚ ０ １ ５年 第 ２期
商 品 化 胎 牛 血 清 及 猪 瘟 疫 苗 中 牛 病 毒 性 腹 泻病 毒 污染 的检测
牛病毒性腹泻与粘膜病精品PPT课件
BVDV的病原学
• 属黄病毒科、瘟病毒属
• 有囊膜，直径25-30nm，正链RNA
• 胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖 传代 BVDV。BVDV 可以分成致细胞病变 型（CP）和非致细胞病变型（NCP）。
BVDV的基因结构及其蛋白
5'-Npro（P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1 (gp25)E2(gp53)-P7- NS2-3 (P125)-NS4A (P10)- NS4B (P30)- NS5A (P58)- NS5B (P75)-3',其中C，ERNS， E1，E2是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白。
近年来，为了避 免非特异性染色反 应，则可以使用单 克隆抗体+生物素化 抗鼠抗体-链酶亲和 素过氧化物酶检测 方法。
分子生物学诊断
1
2
RT-PCR 核酸探针检测
RT-PCR
RT–PCR 是目前广泛应用的分 子生物学技术，对于检测 BVDV 的 RNA 是一个合适的方法。根据 BVDV 基因组序列合成一对或几对特异性 引物，可以高度特异、敏感的检测 出器官、组织、细胞培养物中的 BVDV，并可区别 CSFV、BDV，还可 对 BVDV 的基因型和生物型作进一 步的鉴定
内容摘要
1
BVDV的流行病学
2
BVDV的病原学
3 BVDV的基因结构及其蛋白
4
BVDV的研究进展
5 6
BVDV的主要诊断方法 BVDV的防治
BVDV的流行病学
传 染 源：病牛和带毒牛是主要传染源。
传播途径：主要通过消化道和呼吸道传播；直接或 间接接触也可以传播；吸血昆虫也是重要的传播 媒介。
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关 键 词 ：牛 病 毒 性 腹 泻病 毒 ；Ｎ ｓ ３蛋 白 ；单 克 隆 抗 体
牛病毒性腹泻病毒 （ Ｂ ｏ ｖ ｉ ｎ ｅ ｖ ｉ ｒ ａ ｌ ｄ ｉ ａ ｒ ｒ ｈ ｅ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， Ｂ Ｖ ＤＶ） 是黄病毒科 、 瘟病 毒 属 的 代 表 种 ， 主要 引 起 牛 的 病 毒 性 腹 泻 ， 临床上 以发热 、 腹泻 、 黏膜 糜烂 、 母 畜流产 、 产 死 胎 和 畸 胎 等 为主要特征０ 。Ｂ ＶＤ Ｖ还可感染猪 、 羊、 鹿等其 它偶蹄动 物 。 本病呈世界性分布 ， 在我国 ２ Ｏ多 个 省 均 有 该 病 的 报 道 ， 严 重 危 害牛 、 羊、 猪、 鹿 等养 殖 业 的 发 展 ０ 。 Ｂ ＶＤ Ｖ只有 一 个血 清 型 ， 根据 Ｂ ＶＤ Ｖ 基因组的差异， Ｂ ＶＤ Ｖ 分为 Ｂ Ｖ ＤＶ － １型 和 Ｂ ＶＤ Ｖ 一 ２型０ 。Ｂ ＶＤ Ｖ 为 单 股 正 链 Ｒ ＮＡ 病 毒 ， 全长约 １ ２ ． ３ ～１ ２ ． ５ ｋ ｂ ， 除 ５ 非 翻译 区 （ ５
ＵＴＲ ）和 ３ 非 翻译 区 （ ３ ＂ － ＵＴ Ｒ）外 ， 由 一 个 开 放 阅 读 框 编 码 Ｃ、 Ｅ ｒ ｎ ｓ 、 Ｅ １ 、 Ｅ ２四 种 结 构 蛋 白和 Ｎｐ ｒ ｏ 、 Ｐ ７ 、 ＮＳ ２ 、 ＮＳ ３ 、 Ｎ Ｓ ４ Ａ、 境 检验检疫局动植物检验检疫技术 中心保存 ； Ｏ 型 口蹄 疫 病
毒（ Ｆ ｏ ｏ ｔ ａ ｎ ｄ Ｍｏ ｕ ｔ ｈ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ ，Ｆ ＭＤＶ） 灭 活 抗 原 购 自兰
州 兽 医 研究 所 。 １ ． １ ． ３ 实 验 动 物
Ｂ ａ ｌ ｂ ／ Ｃ小 鼠购 于 广 东 省 医 学 实 验 动 物 中心 。
１ ． １ ． ４ 主 要 试 剂 及 试 剂 盒
Ｐ Ｅ Ｇ一４ ０ ０ ０ 、 Ｉ ＭＤ Ｍ 液体培养基 、 胎牛血清（ Ｆ ｅ ｔ ａ ｌ Ｂ ｏ ｖ ｉ ｎ ｅ
Ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ，Ｆ Ｂ Ｓ ） 、 ＨＡＴ选 择性 培 养 基 、 ＨＴ 选 择 性 培 养 基 、 双 抗 （ 青 霉 素 ＋链 霉 素 ） 为 Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ公 司产 品 ； 弗 氏佐 剂 、 ＨＲ Ｐ标 记 的羊 抗 鼠 Ｉ ｇ Ｇ、 矿物油均为 Ｓ ｉ ｇ ｍａ公 司 产 品 ， 鼠源 单 克 隆 抗 体
１ ： １ ２ ８ ０ ０ ０ 、 １ ： ６ ４ ０ ０ ０和 １ ： １ ２ ８ ０ ０ ０ 。亚型鉴定表明 ， １ Ａ９ 、 ２ Ｃ ３和 ５ Ｄ ５分 别 为 Ｉ ｇ Ｇ１ 、 Ｉ ｇ Ｇ２ ａ 和Ｉ ｇ Ｇ１ 。Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 结 果显 示 ，
３株 单 克 隆 抗 体 仅 与 Ｂ Ｖ ＤＶ ＮＳ ３蛋 白和 Ｂ Ｖ ＤＶ 反 应 ， 不与其它相关病毒反应 ， 表明 ３ 株 单 克 隆 抗 体 特 异 性 良好 。 这 ３株 单 克 隆 抗 体 的获 得 为 建 立 Ｂ ＶＤ Ｖ 免 疫 学检 测 方 法 奠 定 了基 础 。
亚型鉴定试剂盒 （ Ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｍＡｂ Ｉ ｓ ｏ ｔ ｙ ｐ ｉ ｎ ｇ Ｔｅ ｓ ｔ Ｋｉ ｔ ） 购 自 Ｈｙ —
Ｎ Ｓ ４ Ｂ 、 ＮＳ Ｓ Ａ、 ＮＳ ５ Ｂ八 种 非 结 构 蛋 白组 成 “ 。Ｂ Ｖ Ｄ Ｖ 的非 结 构 蛋 白 ＮＳ ３ 蛋 白在瘟 病毒 属 中非 常保 守 ， 具 有 较 高 的免 疫 原性 ， 是一种免疫优 势蛋 白， 在 自然 感 染 或 者 弱 毒 活 疫 苗 免 疫 的 动 物 血 清 中均 可 产 生 针 对 Ｎ Ｓ ３蛋 白 的抗 体 。因此 ，
《 上 海 畜牧兽 医通 讯 》 ２ ０ １ ３年 第 ２期
・ ５ ・
牛病毒 性 腹泻病 毒 ＮＳ ３蛋 白单 克 隆抗 体 的制 备 与鉴定
杨俊 兴 曹琛 福 阮 周曦 吕建强 孙 洁 刘 建利 陶 虹 花群 义
（深 圳 出 入 境 检 验 检 疫 局 动 植 物 检 验检 疫 技 术 中 心 广东 深 圳 ５ １ ８ ０ ０ １）
【 摘 要 】用基 因工 程表 达 的 牛 病 毒 性 腹 泻 病 毒 ＮＳ ３蛋 白 免 疫 Ｂ ａ ｌ ｂ ／ Ｃ 小鼠， 取免 疫 小鼠脾细胞 与 Ｓ Ｐ ２ ／ ０骨 髓 瘤
细胞 进 行 融 合 ， 经 间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ方 法筛选， 获 得 ３株 稳 定 分 泌 抗 Ｂ ＶＤ Ｖ Ｎｓ ３蛋 白 特 异 性 单 克 隆 抗 体 的 杂 交 瘤 细 胞 株 （ １ Ａ９ 、 ２ Ｃ ３和 ５ Ｄ５ ） ， 其细胞培养上 清液 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ效价分 别为 １ ： ２ ５ ６ 、 １ ： １ ２ ８和 １ ： ２ ５ ６ ， 腹水 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 效 价 分 别 为
Ｃ ｕ ｌ ｔ ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ 公 司 。 蛋 白 Ａ／ Ｇ抗 体纯 化试 剂盒 （ 层 析
柱） 购自Ｐ ｉ ｅ ｒ ｃ ｅ 公 司。
１ ．２ 方 法
１ ． ２ ． １ 免 疫 原 的 制 备
可 以 用 重 组 的 ＮＳ ３蛋 白 或 其 截 短 片 段 作 为 诊 断 抗 原 ， 用 于 Ｂ ＶＤ Ｖ 抗体 的检测０ 。本研 究用 原核 表达 的 Ｂ ＶＤ Ｖ ＮＳ ３ 蛋 白免 疫 小 鼠 ， 制 备抗 Ｂ ＶＤ Ｖ ＮＳ ３蛋 白特 异 性 单 克 隆 抗 体 ，
用 于动 物 免 疫 的 抗 原 为 本 实 验 室 前 期 制 备 的 原 核 表 达 的Ｂ ＶＤ Ｖ 纯 化 试 剂 盒 纯 化 后， 用 Ｐ Ｂ Ｓ将 纯 化 的 Ｂ Ｖ ＤＶ ＮＳ ３蛋 白 稀 释 至 ｚ ｍｇ ／ ｍｌ ，