蔗糖酶的分离提纯及酶促(精)

糖酶样品（E1、E2 、E3）的测定（蛋白质含量）； 3、蔗糖酶的分离提纯（细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、
透析和离子交换柱层析—装柱、上样、洗柱、洗脱、收
集酶活力峰、保存）；
4、蔗糖酶米氏常数的测定（用双倒数法）；
5、用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响（含实验设
计及数据处理的相关知识）。
3）记录： ①实验记录本记录要清晰（不许用纸片），实验结束后要

请教师签字； ②记录仪器使用情况。
4）制图： ①标明：曲线名称、纵横坐标的单位、仪器号、使用时间；

②注意实验点的分布、大小（依据误差）、直线的角度

（最好在45度左右）；

③不许延长工作曲线（比耳定律适用于稀溶液中的反应）。
附：标准液的配制：
立即摇匀,在 55℃恒温水浴中保温 5min,用流水冷却 1min 后，测 A650
A650 值
②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。
2019/6/16
18
** Folin-酚法测定蛋白质含量的方法
1.样品的测定：取两支试管（平行）各加入样品液（稀 释成一定浓度的）1ml ，其他操作（反应和比色测
溶解度下降。
6、离子交换柱层析的原理：

是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分
离的技术。在分离过程中，以离子交换作用为主导；在众多
的交换剂中，离子交换纤维素的优点是：
2019/6/16
9
1）有开放性的长链结构、较大的表面积，所以对Pr 的吸附容量大； 2）纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散，对 Pr的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即 可达到分离的目的，不致引起Pr的变性； 3）用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都 不会发生体积的改变，所以有利于Pr的层析。
②以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出 工作曲线。
2019/6/16
16
3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540
（mg） （ml）
（ml）
（ ml）
1
0
0
2.0
3
2 0.4
0.2
1.8
3
3 0.8
0.4
衡量酶提纯的程度和得率。

酶促反应的动力学（反应速度及影响因素）: 1）底物浓
度对酶促反应速度的影响 2）酶浓度对酶促反应速度的影响
3）pH值对酶促反应速度的影响 4）温度对酶促反应速度的影
响 5）激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响.
2019/6/16
4
2019/6/16
5
2019/6/16
8).自备废液杯（盛废液及废纸块用）；
9).各台分光光度计的比色杯是配套的，不许随意调换使用。
3.工作曲线的制作（以Folin-酚法测定蛋白质含量的工作曲线为例）
1）反应：
①取液量准确：移液管洗净、标号、润洗，最好同一人取样；
②温度准确：（恒温水浴中放有温度计），记时准确（用秒表）；
3、制作Folin-酚法测定蛋白质 含量的工作曲线 （当天画出工作曲线）
2019/6/16
11
4、乙醇分级和透析（制E2）

①离心得E1（无细胞抽提液）


取样、测定酶E1活力及蛋白质浓度
② 第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度）
③ 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度）

④ 透析（过夜）

计算出使E1的乙醇浓度达32%时，所需95%乙醇的体积X1，将E1和乙
醇X1，放入冰盐浴中预冷，在不断搅拌下，缓慢滴加乙醇，3000r/min，
离心5min，弃沉淀，留上清；

2019/6/16
23
③ 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度）：
同上法加入X2（为达47.5%乙醇饱和度时需要补加的95%乙醇 的体积），离心3min，弃上清，沉淀立刻用10ml 0.005mol/L pH6.0的磷酸buffer溶解，并装入透析带（截止分子量一万的）， 对上述buffer透析过夜；次日，3000r/min离心3min，得E2，量 体积V2=（ ）ml（留出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活 力及蛋白质浓度），其他酶液准备上样。
试管号
1234567
蛋白质标准液（ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
PH7.8 的 buffer（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Folin-甲试剂 （ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
于室温下不停地振荡 10min
Folin-乙应用液（ml） 4 4 4 4 4 4 4
6
2019/6/16
7
4、Folin-酚法测定蛋白质含量的原理：
1）凡含有两个及两个以上肽键（—CO—NH—）的化合物 （如双缩脲：H2N—CO—NH—CO—NH2），在碱性溶液中（如 Folin-甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物；
2）蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的，故所有 的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成紫色的铜-蛋白质 复合物；
①取11支血糖管编号1—11，按下页表中的顺序和数量 加入葡萄糖标准溶液（0.2%）、蒸馏水、3，5-二硝基 水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟 （注意：①一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管， 且不要用大玻璃杯代替沸水浴锅；②用秒表记时），取 出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇 匀，测定540nm处的A值。
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度

2019/6/16
14
成品E3




计算出E3浓度
周六（全天）上午8：00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定

(2).用正交法测定几种因素

对蔗糖酶 活力的影响

2019/6/16
15
四、操作步骤及注意事项
1、 DNS比色定糖法工作曲线的制作
2019/6/16
12
5、柱层析的准备工作

①组装层析装置
②装柱、柱平衡（过夜）

2019/6/16
13
6、 柱层析（制E3）
周五下1：00开始
① 离心（得E2 ）

② 上样
取样、 测酶E2活力及蛋白质浓度

③ 洗柱（用目测酶活力的方法检测目的酶是否挂上）

④ 洗脱
⑤ 合并酶活力峰,得E3
2019/6/16
3
二、实验原理

前言

酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结
构和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。

酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力）及收率；
依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等）
进行分离; 胞内酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分
离、纯化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的去向、
3）铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷 钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其 颜色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比；
在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、 Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比 紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们选 用本方法。

比色杯的2/3处；

4).如样液有外溢，先用滤纸条吸干（不许檫）；再用镜头纸

向一个方向檫至透明；

5).将装有参比、样品溶液的比色杯放入比色杯架上时，要摆

放在一条直线上；
2019/6/16
20
6).倒出液体后，一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净，然后倒置在滤纸

上吸干；
7).任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上；
定）同工作曲线的制作（前页）
2.蛋白质浓度的计算：

Pr (mg/ml)=

A650值对应的µg数(Pr)×10-3 ×稀释倍数
Pr溶液的ml数
2019/6/16
19
**制作工作曲线的注意事项
1.分光光度计的使用：

1）测样时,光吸收值A应在0.100—0.700之间，并小于标准曲
③所用的标准液、buffer、反应液应是同一批配制的；
④加入Folin-乙试剂时要特别小心！因为Folin-乙试剂只有在酸

性条件下稳定，而反应是在碱性溶液中进行，所以加入Folin-

乙试剂后，一定要迅速摇匀（加一管摇一管）；
2019/6/16
21
2）测量： ①由同一个人读数；

②制作标准曲线及测量样品使用同一台仪器；

①浓度必须准确，要注意烘干、称量、定容等操作；

②分装or取液时防止被稀释！
2019/6/16
22
3、 蔗糖酶粗品（E1）的制备
①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；
5. 柱层析（制E3）
① 装柱：本实验使用的层析柱是自加工的，用泡沫海绵为筛 板。装入纤维素前，先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海 绵,赶尽气泡并把柱子垂直固定；将纤维素用起始缓冲液调稀、 搅允后加入，柱内的纤维素应非常均匀地分布，防止出现节面和 气泡，床面要平整，床高距柱顶2－3cm为宜；用起始缓冲液洗柱, 控制好流速（防止流干），于4℃平衡过夜。