酿酒酵母重组人_2a干扰素补料分批培养_储炬

Vol.27No.42001-08华　东　理　工　大　学　学　报 J ournal of Eas t China University of Science and Tech nology E -mail :juchu@online.s 收稿日期:2000-09-15作者简介:储　炬(1963-),女,江苏宜兴人,教授,博士生导师,工学博士。

研究方向:代谢调控及过程优化 文章编号:1006-3080(2001)04-0349-04酿酒酵母重组人α2a 干扰素补料分批培养储　炬1*,　胡千德1,　郭元昕1,　叶　勤1,　林志伟2,　徐　伦2(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;2.上海万兴生物制品有限公司,上海201206) 摘要:在2.6L 全自动发酵罐中对人α2a 干扰素重组酵母的补料分批培养过程作了初步研究。

结果表明,培养过程中待葡萄糖耗尽时流加葡萄糖,并维持低糖浓度;在培养10h ～20h 时,恒速流加20mg /L 的腺嘌呤,能较大幅度提高表达水平,生物活性从原工艺的 3.1×109IU /L 提高至1.3×1010IU /L 。

表达期p H 值对生产水平有很大影响,宜控制在5.0～ 5.3。

关键词:酿酒酵母;基因工程菌;α2a 型干扰素;补料分批培养;腺嘌呤中图分类号:TQ 920文献标识码:AProduction of Recombinant Human Interferon α2a bySaccharomyces cerevisiae in Fed -batch CultureC HU J u1*,　HU Qian -de 1,　G UO Yuan -x in 1,　YE Qin 1,　LIN Zhi -wei 2,　X U Lun2(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering ECUS T ,Shanghai 200237,China ;2.Shanghai W anx ing Bio -pharmaceuticals Co .Ltd .,Shanghai 201206,China )Abstract:Production o f reco mbinant huma n interfero n α2a by Saccharomyces cerevisiae in fed -ba tch culture w as inv estigated sy stematically in 2.6L autom atic ja r fermenter .During the fermentatio n ,suitable am ount o f g lucose wa s added to keep the g lucose co ncentratio n at lo w lev el,when gluco se w as exhausted;20mg /L o f adenine w as supplemented at ev en speed during 10h ～20h o f ferm entatio n.As a consequence,the ex pressio n lev el of human interfero n α2a has increased by 4times to 1.3×1010IU /L.In ex pressionpha se ,p H v alue has an impor tant im pact on ex pressio n lev el ,which sho uld be co ntro lled within 5.0～ 5.3.Key words :Saccharomyces cerevisiae ;cultiva tion of recombina nt yea st;IFN-α2a,fed-ba tch cultiva tion;adenine 人α2a 型干扰素(IFN-α2a )是国外已大量生产和广泛应用的抗病毒及抗肿瘤多肽药物。

它是由165个氨基酸组成的单链多肽,分子质量为19.219ku。

它对不同人体肿瘤有抗增生作用,能抑制病毒核酸密码的转录和分解病毒的RN A 核酸,是一种具有调节免疫力,治疗乙型、丙型肝炎,白血病,卡波氏肉瘤(艾滋病相关的)等的多功能细胞因子[1]。

酿酒酵母是迄今为止研究最深入的真核生物,它具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制,和更强的对表达产物的加工修饰及分泌能力。

因此,酿酒酵母作为基因工程的表达系统日益得到广泛应用,并已成功地表达了多种外源基因[2]。

本文在研究人α2a 干扰素酵母工程菌高产培养条件的基础上[3],采用2.6L 多参数监控发酵罐对人α2a 干扰素重组酿酒酵母进行了补料分批培养。

349DOI:10.14135/ k i .1006-3080.2001.04.0061　材料与方法1.1　试验菌株发酵中使用的酵母工程菌为DCO4(Cir 0,pHC 11-IFN αA 1),经重组质粒pHC 11-IFN αA 1(由人-αA 干扰素基因表达分泌单元插入高稳定载体pHC11构成)转化Saccharomyces carlsbergensis DCO4(C ir 0,M ATa,ade1,leu2-04)得到[4],由上海万兴生物制品有限公司提供。

1.2　培养装置试验装置采用日本丸菱公司制造的M D-250型台式发酵罐。

发酵系统配有溶解氧、pH 、温度和转速等传感器,其信号由专用放大器放大,经A /D 卡送上位计算机,并采用华东理工大学国家生化技术研究中心(上海)开发的生物反应器数据分析专用软件包对培养过程进行实时数据采集,见图1。

培养过程中能在线显示p H ,溶解氧,温度,转速等参数的变化。

图1　补料分批培养系统示意图Fig.1　Setup of the fed-batch cultiv ation system1—Air filtration;2—Glucos e flas k;3—Peris talticpump;4—Feed flask;5—Ferm enter;6—Th ermome-ter ;7—p H electrode ;8—DO probe ;9—Sig nal amplifi-er;10—A /D converter;11—Computer1.3　培养基和培养条件SD 种子培养基(g /L):YNB (Yea st nitrog en base W /O amino acids,Difco,Lab.Detroit,Michigan,U SA)6.7,葡萄糖20,腺嘌呤0.04,p H自然。

酵母发酵培养基(g /L):酵母提取物(Difco ,Lab.Detroit,Michig an,USA)15,聚蛋白胨(日本)20,葡萄糖20,Tween-202,腺嘌呤0.02,p H 自然。

用移液管从冷冻甘油管中吸1m L 种子液于75m L SD 种子培养基(500m L 三角瓶)中,置30°C 旋转式摇床(240r /min)恒温培养18h ,以5%接种量接入M D -250发酵罐内的 1.5L 发酵培养基中,于30°C 培养36h 。

1.4　分析方法菌体浓度:样品稀释后于OD 600测定细胞生长。

样品经离心和洗涤后,烘干至恒重,秤细胞干重(DCW )。

蛋白浓度:用蛋白测定试剂(Bio -Rad )显色,测定在595nm 的光密度。

葡萄糖浓度用酶试剂盒测定。

酵母质粒稳定性测定:将SD 平板上的酵母转化子接种到2m L YEPD (含酵母粉、聚蛋白胨和葡萄糖)培养液中即为0世代菌,在30°C 摇床培养24h 后即为10世代菌,取2μL 10世代菌接入2m L Y EPD 培养液中,30°C 摇床继续培养24h ,即为20世代菌,以此类推,连续培养50世代,从0世代起,每隔10世代取少量菌液,经适当稀释后,涂布于Y EPD 平板,30°C 培养24h 后,将YEPD 平板上的菌落转接到SD 平板上,培养72h 后按下列公式计算质粒的稳定性。

质粒n 世代稳定性=(n 世代SD 平板上生长菌落数/n 世代Y EPD 平板上生长菌落数)/(0世代SD 平板上生长菌落数/0世代Y EPD 平板上生长菌落数)人α2a 型干扰素生物活性测定:细胞病变抑制法[2],用W ISH 细胞/V SV 系统,由上海万兴生物制品有限公司测试室测定。

乙醇测定:气相色谱法。

2　结果与讨论2.1　重组酿酒酵母人α2a 型干扰素发酵过程基本代谢规律将在SD 种子培养基中培养了18h 的种子,以5%接种量接入2.6L 台式玻璃发酵罐中,全程温度控制在30°C,空气流量0.6L /min,在10h ～20h 时,匀速流加1/8全料,至培养30h 时,用N H 4O H 调p H 到6.30左右,36h 培养结束。

图2为人α2a 型干扰素发酵过程基本代谢曲线。

从图中发酵数据看,葡萄糖在12h 左右已基本耗尽,OD 600值在4h ～22h 快速增长,然后基本维持在14～15。

整个培养过程DO 均保持60%以上水平,为非限制状态。

而乙醇在生长期0～10h 时逐渐增加至71g /L,而后进入生产期,由于酵母细胞自身的消耗,乙醇含量逐渐下降至20g /L 左右,显然,乙醇含量还过高。

在补料分批培养重组酿酒酵母时,乙醇的积累是抑制细胞生长及阻遏外源蛋白生成的主要原因[5]。

故从20h ～36h IFN-α2a 干扰素生物活性没有明显提高,在36h 放罐时的生物活性为 3.1×109IU /L 。

2.2　培养过程中后期补加葡萄糖本批实验大约在14h 时葡萄糖几乎全部用完,因此在原补料工艺基础上在糖耗完时进行葡萄糖分批补加,每次流加0.05g /L 葡萄糖,约2h 左右,待350 华　东　理　工　大　学　学　报第27卷糖耗尽后继续流加0.05g /L 葡萄糖。

培养过程各参数变化如图3所示。

可见,中后期进行适当批补葡萄糖,维持低葡萄糖水平,使乙醇含量大幅度下降,乙醇积累减缓,使更多的碳源流向产物。

IFN-α2a 干扰素生物活性提高到 4.9×109IU /L。

图2　人α2a 型干扰素发酵过程基本代谢曲线Fig.2　Basic meta bo lic chang es during human α2ainterfe ro n fer mentatio n○—OD 600;□—Residual glucose;◇—Protein;△—DO ;●—Eth anol ;■—Biologicalactivity图3　培养中后期补糖对各参数变化的影响Fig .3　Effect o f th e additio n of glucose o n va rio us pa-ra meters during th e late phase of fermenta tion○—OD 600;□—Residual glucose;◇—Pro tein;△—DO ;●—Ethanol ;■—Biological activity2.3　流加腺嘌呤(Ade )对重组酵母表达人α2a 干扰素的影响由于本实验菌株的遗传背景是腺嘌呤缺陷的,发酵过程中若Ade 耗尽,将会严重影响重组菌的生长及外源蛋白的表达,为此,实验流加Ade 。