柱后衍生原理和关键点

注！水解试剂不建议自己制备，因为很难 得到足够纯度的NaOH 。
反应试剂的准备
2. OPA试剂
a. 倒入945mL OPA稀释剂（CB 910）到反应试剂瓶中 （留下5mL备用）。 b. 盖上瓶盖，打开Vent阀，打开气源，用惰性气体鼓 泡至少10分钟。 c. 溶解100mg OPA到大约10mL HPLC级甲醇中。 d. 关闭气源，移走瓶盖，加入OPA溶液到已经脱氧的 OPA稀释剂瓶中。 e. 溶解2g Thiofluor (Cat. No. 3700-2000)到刚才剩下 的5mL OPA稀释剂中，然后加入到反应试剂中。 f. 盖上瓶盖并打开气源，连续鼓泡1min。轻摇试剂瓶 直到完全混合。
衍生化分类
1. 从是否形成共价键来说，可分为：标记 和非标记反应。
标记反应是在反应过程中，被分析物与标记试 剂之间生成共价键； 所有其它类型的反应，如形成离子对、光解、 氧化还原、电化学反应等都是非标记反应。
2.从衍生反应的场所来说，可分为：
柱前衍生化(pre-columnderivatization)；柱上 衍生化(on-columnderivatization)；柱后衍生化 (post-columnderivatization)三种。
检测条件：
荧光检测器：λex 330nm , λem 465nm 氨基甲酸酯分离柱（4.6×250mm）, C18, 5um
反应试剂的准备
水 解 试 剂 OPA 衍 生 试 剂
反应试剂的准备
1.水解试剂
用甲醇彻底清洗两个反应试剂瓶，并用甲醇清 洗浸在反应试剂中的管线。 水解试剂不需要制备，直接将水解试剂(CB 930)倒入到标有水解试剂标签的反应试剂瓶中 。
柱后衍生是分离物在分析柱中实现分离后 ，在衍生池内与衍生剂反应，在柱子中分 离的是目的物，在检测器处检测的衍生产 物。
柱前衍生法的优缺点
优点：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 相对自由地选择反应条件； 不存在反应动力学的限制； 衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰； 容易允许多步反应的进行； 有较多的衍生化试剂可选择； 不需要复杂的仪器设备。
氨基甲酸酯类农药的柱后衍生
氨基甲酸酯类农药按照在C18、 C8柱上的 洗脱顺序流出。 分离后的氨基甲酸酯农药首先在100℃下在 NaOH作用下水解释放出醇，碳酸盐和甲胺 。在第二个柱后反应中甲胺与邻苯二甲醛 （OPA和2-巯基乙醇反应生成有强荧光吸 收的1-甲基-2-蚓哚类化合物，被荧光检测 器检测且具有很低的检测限，满足残留分 析方法的要求。
注意!
如果没有Thiofluor(N,N-二甲基-2-巯基乙胺盐酸盐 )，移取1mL 2-巯基乙醇。处理2-巯基乙醇应该在 通风橱内进行，因其易挥发和不愉快的臭味。 不推荐自己制备OPA稀释剂，因为硼酸钠（任何 级别）含有过量的重金属和不溶物，这些杂质最 终会沉淀在反应器和流通池内。 水解试剂比较稳定，而OPA试剂易于氧化且一直 降解。在惰性气体体密封下，OPA试剂可以维持 两周而没有明显的活性降低。
问题？
谢
谢
Thank you
清洗系统
衍生试剂换成水冲洗管路30min； 反应池温度设为小于60℃； 将水换成水/甲醇（80/20）溶液，再冲洗 30min。 不同仪器不同功能，可根据仪器的操作手 册操作。
氨基个农药有效的分离； 水解试剂和衍生试剂不可以弄错，如果反 发了则无法衍生； 反应试剂给予的流速一定要稳定；反应池 的温度控制也一定要稳定； 做好回收率试验。
2、反应选择性高，最好只于目标化合物反应。 3、衍生化产物只有一种，反应的副产物和过量的 衍生化试剂应不干扰目标化合物的分离和检测。 4、衍生化试剂通用性好，价廉易得。
衍生化方法应用不当的弊端
1、柱上衍生化可能损伤色谱柱。
2、某些衍生化试剂需氮气吹干。 3、衍生化不完全，影响灵敏度。 4、衍生化试剂不当，产物分子量过大。
缺点：
1. 对于一定的溶剂和有限的反应时间来说，目前只有有 限的反应可供选择； 2. 需要额外的设备，反应器可造成峰展宽，降低分辨率 。
柱后衍生技术的应用
氨基酸； 链霉素以及其他氨基糖苷类抗生素，包括：庆大 霉素、阿泊拉霉素、新霉素等。 氨基甲酸酯：
涕灭威亚砜、涕灭威砜、草氨酰、灭多虫、3-羟基呋喃 丹、涕灭威、残杀威、呋喃丹、 西维因（胺甲萘）、 1-萘酚、灭虫威、BDMC内标
氨基甲酸酯类农药的柱后衍生
原理
氨基甲酸酯类农药的柱后衍生
柱后衍生系统图
氨基甲酸酯类农药的柱后衍生
氨基甲酸酯分析的柱后条件：
衍生试剂1：水解衍生试剂CB 130 衍生试剂2：100mg OPA, 2g Thiofluor溶解于950mL CB 910 反应器1：100℃，0.5mL 反应器2：环境温度 衍生试剂流速：0.3mL/min
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氨基甲酸酯类农药的柱后衍生
简介及关键点
主讲：何亚斌
2012.07
衍生化的定义
衍生化是一种利用化学变换把化合物转 化成类似化学结构的物质。
草甘磷以及百草枯、敌草快等除草剂 黄曲霉毒素等毒素。 其它应用： 聚醚抗生素、串珠镰孢毒素、贝毒等 毒素、单端孢莓稀毒枝菌素和赭曲霉 毒素、生物 胺、甲醛、类固醇等。
如何实现柱后衍生
衍生试剂
原理
氨基甲酸酯类农药的柱后衍生
原理 氨基甲酸酯类农药的结构中均含有下N-甲 基氨基甲酰基。
衍生化试剂
简单的说:它能帮你将不能分析的样品通过 衍生化试剂反应转化为可分析的化合物.
种类:烷基化试剂、硅烷化试剂、酰化试剂 类、荧光衍生化试剂、 紫外衍生化试剂、 苯甲酰氯为衍生化试剂、羟基衍生化试剂 、 手性衍生化试剂、氨基衍生化试剂。
判断衍生化反应的指标
1、反应是否迅速、定量进行，反应重复性好坏， 反应条件是否温和，是否容易操作。
3.从是否与仪器联机的角度来分有：
在线(on-line)、离线(off-1ine)和旁线(at-line)(自 动化)三种。
目前在HPLC中以离线的柱前衍生法(简称 柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后 衍生法)使用居多，旁线衍生化方法是发展 方向。
柱前衍生和柱后衍生定义
柱前衍生是在经过分析柱前使分析物与衍 生剂反应，反应产物在分析柱上实现分离 ，实际分离的是衍生产物，检测的也是衍 生产物;
缺点：
1. 形成的副产物可能对色谱分离造成较大困难； 2. 在衍生化过程中，容易引入杂质或干扰峰，或使样品 损失。
柱后衍生的优缺点
优点：
1. 形成副产物不重要，反应不需要完全，产物也不需要 高的稳定性，只需要有好的重复性即可； 2. 被分析物可以在其原有的形式下进行分离，容易选用 已有的分析方法。
一般来说，一个特定功能的化合物参与衍生反 应，溶解度，沸点，熔点，聚集态或化学成分 会产生偏离。由此产生的新的化学性质可用于 量化或分离。
衍生化的目的
衍生化最为主要的目的就是提高目的物的可检测 性。把难于分析的物质转化为与其化学结构相似 但易于分析的物质，便于量化和分离。 对于GC来讲，多数是为了增强目的物挥发性或者 改善目的物极性; 对于HPLC来讲多数是为了提高检测器对目的物 的响应。 衍生化常用的反应有酯化、酰化、烷基化、硅烷 化、硼烷化、环化和离子化等