病原分子生物学实验技术-2013
分子生物学检验技术
分子生物学检验技术分子生物学检验技术是一种用于研究和分析生物分子如DNA、RNA和蛋白质的技术手段，广泛应用于生命科学研究、医学诊断、药物研发等领域。
它的发展给生物学和医学研究带来了革命性的变化，为人类健康和疾病治疗提供了重要手段。
分子生物学检验技术有多种方法，其中最常见的包括：聚合酶链反应（PCR）、核酸杂交、DNA测序、蛋白质电泳等。
这些技术在生物学研究和医学诊断中发挥着重要作用。
聚合酶链反应（PCR）是一种通过体外扩增DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶酶和引物，通过多次循环反应，在较短的时间内扩增出大量目标DNA片段。
PCR技术广泛应用于基因检测、病原体检测、遗传疾病筛查等领域。
核酸杂交是一种通过互补配对原理来检测目标序列的技术。
它利用标记的探针与待测样品中的目标DNA或RNA序列互相结合，通过检测探针的标记物来确定目标序列的存在与否。
核酸杂交技术广泛应用于基因表达研究、病原体检测、基因定位等领域。
DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
它通过化学或物理方法对DNA 分子进行断裂、扩增和测序，最终确定DNA的碱基序列。
DNA测序技术是基因组学研究的重要工具，也是研究基因突变、病因分析等领域的基础。
蛋白质电泳是一种通过电场作用使蛋白质在凝胶中分离的技术。
它根据蛋白质的大小、电荷和结构差异，将混合样品中的蛋白质分离成不同的条带，从而实现对蛋白质的分析和检测。
蛋白质电泳技术广泛应用于蛋白质组学研究、疾病标志物筛查等领域。
除了上述常见的技术，分子生物学检验技术还包括许多其他方法，如基因芯片技术、原位杂交技术、蛋白质质谱等。
这些技术在不同领域有着特定的应用，为科学研究和医学诊断提供了更多的手段和思路。
分子生物学检验技术的发展不仅推动了科学研究的进展，也在医学诊断和治疗中发挥着重要作用。
例如，在基因检测中，通过分子生物学检验技术可以检测人体携带的致病基因，帮助人们了解自己的遗传状况，预防或早期干预遗传性疾病。
分子生物学诊断技术进展
3
4 5
8
16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
22
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
6 20 30
7 cycle = 128 Amplicon
荧光PCR原理 – TaqManTM技术
λ
Q
R
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， 所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。
18
PCR 循环 第二步–引物与靶序列退火
19 引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。55℃左右
PCR 循环 第三步 - 引物延伸
在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始, 沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。72℃左右 20
14
分子生物学技术在其它领域的应用
在基础研究领域中的应用； 遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 如血友病、地中海贫血等 肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测； 骨髓移植、器官移植供体配型选择； 法医学、动植物学、古人类学、古生物学； 与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激 素、受体）的基因表达的检测； 药物基因组学、耐药基因的检测，等等
4、质谱
利用色、质谱结合PCR技术
6
分子诊断的功能及扩展
病原的诊断和鉴别诊断 病原分型 病毒载量监测---个体化治疗的依据 疗效及预后标志 其他：病原感染中发生、发展各阶段
7分子诊断的功能及扩展 Nhomakorabea疾病分型及意义
例如：HPV （30/100） 高危---16，18，31，45 低危--- 6，11
分子生物学技术在病原微生物检验的应用——医疗小常识科普
分子生物学技术在病原微生物检验的应用——医疗小常识科普最近几年，由于科学技术的迅猛发展，在病原微生物检测过程中，利用分子生物学技术在某种程度上，大大推动了向新型微生物经验方法的转变。
其在检测微生物上面应用很广泛，而且优势也日益突出，分子生物学技术能够通过对生物大分子功能、机理和生物合成的研究，达到检测的目的，从而提高检测的准确性。
今天，将为大家带来一些有关分子生物技术的相关应用介绍，让我们来一起了解一下。
一、什么是分子生物学技术？在生物研究领域中，由于生物技术的进步，人们对生物的认识正逐步向微观层面推进。
对生物体的研究早已由生物体深入到了器官组织上，再到更微小细胞，从微小的细胞结构又深入到了核酸和蛋白的分子水平上来，人们发现可以通过检测分子水平的线性结构将同物种进行横向对比，从而发现同一物种不同个体和不同生理状态的区别。
这就为生物学和医学的各个领域提供了一个强有力的技术平台。
分子生物学是一种基本的技术科学。
主要从事RNA、 DNA、蛋白质的结构、功能调节以及对它们之间的联系和作用等进行研究，是一种新的微生物检测手段，通过这种手段，可以使检测对象更加广泛，检测结果更加准确。
二、分子生物学技术的优点是什么？近几年，分子生物学已被广泛地用于微生物检测，并取得了很好的成效，并受到有关科研单位和有关部门的一致好评，对农业、医药、食品工业的迅速发展起到了巨大的推动作用。
在微生物检验领域属于一种全新的技术，该技术的应用扩大了微生物的检验范围，在对病原菌进行检测的时候，一般会使用到PCR（聚合酶链式反应）技术、基因芯片技术、蛋白质指纹图谱技术和核酸探针技术等等，为微生物的检验提供了新的途径，使诊断更加快速、简便和准确。
从而推动生物研究的可持续发展。
三、在病原微生物检验中生物分子学技术的具体应用1、PCR（聚合酶链式反应）技术PCR是一种在生命科学中被广泛应用的分子生物学技术，该技术是由延伸、退火、变性等几个反应构成，利用体外酶促进 DNA片段的生成，经过这些反应的持续循环最终达到对 DNA扩增的目的。
临床分子生物学检验技术
04
优势：快速、准确、灵敏度高
05
局限性：成本高、技术要求高、需要专业人员操作
遗传病诊断
基因检测：通过基因测序技术， 检测遗传病相关基因突变
产前诊断：通过基因检测，评估 胎儿遗传病风险，指导优生优育
遗传咨询：根据基因检测结果， 提供遗传病风险评估和预防建议
药物治疗：根据基因检测结果， 制定个性化的药物治疗方案
04 跨界合作：与其他领域的技 术相结合，如人工智能、大 数据等，为分子生物学检验 技术带来更多的市场机遇。
汇报人：xxx
液体活检技术的发展： 通过血液样本检测肿瘤 细胞，提高了肿瘤检测
的准确性和便捷性
生物芯片技术的应用： 用于基因表达分析、 基因分型等，提高了 检测效率和准确性
单细胞测序技术的发展： 实现了对单个细胞的基 因表达分析，提高了检
测的灵敏度和分辨率
基因编辑技术的发展： CRISPR/Cas9等基因 编辑技术的出现，为基 因治疗提供了新的可能
市场前景与机遇
01 市场需求：随着人们对健康 重视程度的提高，分子生物 学检验技术在医疗领域的应 用将越来越广泛。
02 技术进步：随着分子生物学 技术的不断发展，检验技术 将更加精准、高效，为市场 带来更多机遇。
03 政策支持：政府对医疗领域 的投入加大，为分子生物学 检验技术的发展提供了有利 的政策环境。
生物学与工程学的融合：分子 生物学检验技术需要利用工程 学原理和方法，如微流控芯片、 纳米材料等，进行生物大分子 的检测和分析。
技术瓶颈与难题
技术难度：分子生物学检验技术涉及 多个学科，技术难度较大
成本问题：分子生物学检验技术成本 较高，难以普及
检测准确性：分子生物学检验技术检 测准确性有待提高
分子生物学技术在病原微生物检测中的应用
分子生物学技术在病原微生物检测中的应用近年来，随着分子生物学技术的不断发展，病原微生物检测已经从传统的生物学检测方法向分子生物学检测方向转变。
分子生物学技术能够快速、高效、准确地检测病原微生物，这对于疾病的防治有着非常重要的意义。
分子生物学技术主要包括PCR、基因芯片、DNA测序等技术。
这些技术可以对病原微生物进行快速检测，减少了传统检测方法的时间和成本，并且不需要在培养基上进行繁殖。
这样，分子生物学技术可以避免许多因样品损失、生长较慢或重复测试等原因导致的误诊。
以PCR技术为例，PCR可以扩增特定的DNA片段，实现对微生物的检测。
PCR技术具有极高的灵敏度和特异性，最低检出量可以达到基因组中存在的个别基因。
在临床上，PCR技术已经广泛用于各种感染疾病的诊断，如病毒性肝炎、结核病、呼吸道感染等等。
而对于一些特定的病原体，一般会采用特异性引物对其进行检测。
例如，对于流感病毒，我们可以选择一个与其外壳蛋白HA基因序列相对的引物进行PCR扩增，扩增出的目标DNA片段可以被证实为和流感病毒有关。
同时，PCR技术也适用于其他一些微小的微生物，例如细菌、真菌、原生动物等等。
在实际操作中，PCR技术一般需要提取样品中的DNA，将其与引物混合后进行PCR扩增。
这种方法已经成为检测病原微生物的标准方法。
而随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的方法可以用来检测病原微生物。
基因芯片技术，也叫微阵列技术，是依据DNA杂交技术原理实现的。
基因芯片技术可以同时检测数万个基因，可以帮助快速检测多个病原菌。
通过与数据库中的基因序列比对，可以得到病原体是否存在和数量的信息。
而DNA测序技术，则是一种将DNA序列化并逐一测试的技术，可以将DNA与基因组进行比对，确定微生物的特异性。
DNA测序技术具有高精度、高灵敏度、高通量等特点，可以帮助扩大微生物检测的范围。
总的来说，分子生物学技术在病原微生物检测中有着广泛的应用，不仅在医学领域大有用处，在环境保护、食品安全等方向也有着重要的应用。
分子生物学实验技术实验报告
2013年分子生物学实验技术实验报告实验名称：口蹄疫病毒VP1蛋白的表达姓名：学号：班级成绩一、实验目的本实验从口蹄疫病毒核酸的提取、分离、纯化、鉴定等实验技术入手，通过DNA技术、RNA技术和蛋白技术实验技术的应用，训练学生掌握分子生物学的基本试验方法和操作技能，进一步巩固理解分子生物学的基础知识和相关理论，从而为毕业论文选题和开展分子生物学方面的研究项目奠定基础。
二、实验材料与器材1、病毒样品：口蹄疫病毒强毒株和阳性口蹄疫冰帝VP1重组质粒2、仪器设备：凝胶图像分析系统、PCR仪、恒温水浴锅、培养箱、高速台式离心机、超低温冰箱、漩涡混合器、微量移液器等3、试剂：pMD -18载体、PCR胶回收试剂盒，反转录试剂盒等4、溶液：LB液体培养基，电泳缓冲液，0.1mol/l Cacl2溶液，氨苄青霉素母液，10％SDS，10％过硫酸铵，1.5M Tris-HCL，1M Tris-HCL，考马斯亮蓝染色液，脱色液，电转缓冲液，包被液，显色液等三、实验方法（一）反转录聚合酶链反应（RT-PCR）1、口蹄疫病毒总RNA的提取1.1将250μL液体口蹄疫病毒样品加入1.5mL离心管中，再加入750μL预冷的冰RNAiso Reagent。
1.2 将样品剧烈混合后，在室温静置5分钟。
1.3 加入200μL氯仿，颠倒离心管混合两次，并剧烈震荡混匀，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5分钟。
1.4在4℃条件下，以12000×g 离心15分钟。
1.5将上层水相转移到一个新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少10分钟。
1.6在4℃条件下，以12000×g离心15分钟后，小心并尽可能地除去全部上清液。
1.7用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁，4℃ 12000×g 离心5分钟后小心弃去乙醇。
1.8将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μL无RNase污染的水（RNase-Free water）将RNA溶解并于-20℃保存备用。
分子生物学技术在病原微生物检验中的应用
引言
２ １世纪 是 以分 子 生 物 学 为 代 表 的生 命 科 学 的 时 代， 近年来 发展 起来 的分 子 生 物学 基 因诊 断 技术 在 医 学 、遗传 学等各 个 领域 广 泛 应 用 ， 动 着 现 代 医 学 由 推 细胞水 平 向分 子水 平 、基 因水 平 发 展 ， 成 了分 子微 形
生物 学 ， 人们 对微 生 物 的 认识 逐 渐 从 外 部 结 构 特征 使 转 向内部基 因结 构 特 征 ， 生 物 的检 测 也 相 应 的从 生 微 化免疫 方法 转 向基 因水 平 的检测 。
Ｐ Ｒ（ Ｔ Ｐ Ｒ） Ｃ Ｒ ２ Ｃ 、多 重 Ｐ Ｒ 、巢 式 Ｐ Ｒ 、 Ｐ Ｒ单 链 Ｃ Ｃ Ｃ 构 象 多态性 （ Ｃ ２ Ｓ Ｐ 、 Ｒ Ｌ Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ ＳＣ ） Ｆ Ｐ Ａ Ｄ技 术 、荧 光 定 量 等 ， 中定量 Ｐ Ｒ既 可 以用 于 临 床感染 性 疾病 的诊 其 Ｃ
次运 用 ｒ Ｎ Ｒ Ａ分 析 以来 ，Ｒ Ａ 数据 库 快速 扩 大 起 来 ， ｒＮ 其成 为研 究 细菌 多样性 ， 进化 ， 系统 发育 中被广 泛采 用 的序 列 ，６ ｒ Ｎ １ＳＲ Ａ存 在 于所 有原 核 生 物 细 胞 中 ， 们 它 相对 稳定 且有 较 高 的拷 贝数 （ 个 细 胞 几 千个 拷 贝 ） 每 ，
ｌ 探 针 杂 交 技 术 的发 展 及 其 应 用
随着分 子生 物学 不 断发 展和基 因工 程技 术广 泛应
用 ， 们认识 到 核苷 酸序 列 （ Ｎ 是 构建 生 命 的物 质 人 Ｄ Ａ） 基 础 ， 同种生 物 体 含有 不 同 的 Ｄ Ａ序 列 ， 不 Ｎ 同种生 物 体 含有 相 同的 Ｄ Ａ序 列 ， 们利 用 核苷酸 碱基 顺序 互 Ｎ 人
分子生物学检验完整版
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？原癌基因是指人类或其他动物细胞(以及致癌病毒)固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。
特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。
功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。
临床特征：生长发育障碍，智力低。
呆滞面容，又称伸舌样痴呆。
40%患者有先天性心脏畸形。
肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。
核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX(XY),+212.5%患者为嵌合型：46，XX(XY)/47，XX(XY),+215%患者为易位型：46，XX(XY),-14，+t(14q21q)4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。
2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。
3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。
分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析等。
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实验一 聚合酶链反应（PCR）
4、反应条件（要摸索最佳条件，尤其 是退火温度；如何降低非特异性） 95℃变性
5 Min
94℃
1 ‘
1 ‘
58℃
30’’
35个循环
72℃ 72℃延伸10 min 4℃
实验一 聚合酶链反应（PCR）
5、电泳检测
取8-10μl扩增产物于上样膜上，加1.5μl上样缓冲 液混匀后点样。 0.8%琼脂糖凝胶的配制： 称取0.8g琼脂糖粉，加入100ml 1×TAE中，加热煮沸使琼 脂糖完全熔化，稍稍冷却后，加入5μl 10mg/ml的溴化 乙锭（EB），混匀后倒入电泳槽中，制备凝胶。
实验四 连接产物转化
5、取100μl转化的感受态细胞转移到含相应抗生素（Kan ）的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均 匀地涂布到琼脂平板表面。 6、将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培 养，12-16h可出现菌落。
注意事项：热激时间、复苏转速、新制备的平皿注意“发汗” 如果是转化质粒，可以简化复苏这一步
五、转化大肠杆菌DH5α
本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE
实验基本原理的思考题：
1、PCR引物设计原则 2、PCR的种类及用途 3、提高PCR反应特异性的策略 4、限制性内切酶的同尾酶、Star活性
病原分子生物学实验技术
保护性碱基
通常保护性碱基添加2-3 个，但是不同公司的限制 性内切酶的保护碱基个数 有所不同 可通过添加不同保护性碱 基，使上下游引物GC含量 尽可能一致 根据实验要求添加酶切位 点和保护性碱基，如果 PCR产物直接连T载体则可 不用添加保护性碱基 TaKaRa公司
实验一 聚合酶链反应（PCR）
王荡
wangdang511@
华中农业大学动物病毒室 2013级
本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE
实验三 感受态细胞的制备
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏
用接种环以无菌操作取细菌悬液，在平板培养基的一边，做第一次平行划线。 转动培养皿，用烧过冷却的接种环，通过第一次划线部分，做第二次平行划线。 用同法通过第二次平行划线，做第三次平行划线。
PRRSV ORF7的PCR扩增 1、引物 P1：5’-CATGGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’ (BamHI) P2：5’-CACAAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’ (HindIII) 2、模板（质粒） 用前于沸水浴中变性10min，迅速置冰浴上不少于3min
读码框校正（Sal I+Xho I）
30a（+）
5‘-CGTCGACATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGACTCGAG -3’
Arg-Arg-His-(移码的PRRSV ORF7)
读码框校正（Sal I+Xho I）
30a（+）
5‘-CGTCGACAAATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGACTCGAG -3’
注意事项：菌体不能超过对数生长期；冰上操作；无菌操作
感受态细胞效率检测
Amp+ Kan+
直接涂感受态
直接涂感受态
转Amp+抗性的质粒
转Kan+抗性的质粒
实验四 连接产物转化
1、取100μl感受态细胞悬液转移到无菌的1.5mlEP管中， 加入10μl连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放 置30min（实验中设一不加质粒DNA的对照）。 2、将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒 3、快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。 4、每管加400μl LB 培养基。用水浴将培养基加温至37℃ ，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌 复苏。（为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/ 分）。
实验五/六 质粒提取
目前已经有商品化试剂盒，但通过经典方法提取，有助 于掌握基本原理。 在购买质粒提取试剂盒时，应注意所提取质粒的用途， 如果是用于将来的转染或动物实验，应采用去内毒素的 试剂盒。
沉淀法回收PCR产物
1、将3管PCR产物混合后加入适量的水至500ul，加等体积的苯酚∶氯 仿∶异戊醇（25∶24∶1）涡旋混匀，12000r/min离心5min 2、取上层液相于另一离心管中，加2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体 积的3M NaAc，混匀后于-20℃沉淀30min 3、12000r/min离心5min，小心吸去上清液，将离心管倒置于吸水纸 上，以使所有液体流出 4、用70%乙醇洗一次，倒掉洗液并倒置吸水纸上让痕量液体流尽。然 后用真空干燥器抽干或自然干燥直到无乙醇气味 5、用35μl ddH2O溶解
PCR电泳检测结果
M1 1 2 3 4 5 6 7 M2
15000bp 2000bp 500bp 250bp 100bp 2000bp 1000bp 250bp
对照
ORF7 PCR产物
胶回收法回收PCR产物
1、将PCR扩增产物，在0.8%琼脂糖回收胶中上样电泳。 2、在长波紫外灯下，用刀片切下目的片段，装入1.5ml离心管中 ，按回收试剂盒说明书进行回收，最后用20μl ddH2O洗脱， 获得目的片段
酶切体系： DNA 10X Buffer K BamHI HindIII ddH2O 37℃ 2-3h 4.0μl(根据浓度确定用量） 3.5μl 1.0μl 1.0μl 25.5μl
酶切注意事项
了解各种限制性内切酶的特性与使用 Star活性（注意酶的用量、时间、温度） 酶切时间 酶切温度 双酶切(侧翼序列、Buffer)
实验要求
1、注重实验设计 2、严格操作程序 3、注意生物安全 4、了解实验原理
实验预期目标
1、掌握DNA操作和原核表达的基本实 验技能 2、提高独立进行实验设计的能力 3、了解DNA操作和原核表达实验技术 的基本原理(自己查资料）
参考书：分子克隆实验指南
本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE
实验一 聚合酶链反应（PCR）
以原核表达PRRSV ORF7基因为例 引物设计 模板制备 PCR反应体系以及扩增条件 PCR产物电泳检测
载体选择
蛋白特性分析（信号肽、跨膜区）
/tools/
SignalP软件
引物设计
上游引物：ATGCCAAATAACAACGGCAAGC 下游引物：TCATGCTGAGGGTGATGCTGTG
实验一 聚合酶链反应（PCR）
引物的设计 已知基因序列 部分序列已知 5’/3’ RACE 高度变异序列 简并引物
实验一 聚合酶链反应（PCR）
模板的处理 细菌 细胞培养物 质粒 病毒基因组DNA 病料 鼻拭子
实验一 聚合酶链反应（PCR）
PCR PCR （DNA) RT-PCR (RNA) 套式PCR 荧光定量PCR
酶切位点添加
载体自连？
PRRSV ORF7酶切位点
插入方向？ 同尾酶？
读码框校正（BamH I+Hind III）
30a（+）
5‘-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGAAAGCTT -3’
Gly-Ser-Met-(PRRSV ORF7)-(TGA)
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏 2、从大肠杆菌DH5α平板中挑取一个单菌落，转到一个含 50mL LB培养基的盐水瓶中，于37℃ 300转/分剧烈振荡 培养3-4h。为得到有效转化，活细菌数不应超过108细胞 /ml，一般以稍见浑浊为宜。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌，用冰预冷的50ml 聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到 0℃。 4、于4℃ 4000转/分离心10min，回收细菌。
病原分子生物学实验技术
王荡
wangdang511@
华中农业大学动物病毒室 2013级
实验内容
实验一、聚合酶链反应（PCR） 实验二、外源DNA片段的克隆 实验三、感受态细胞的制备 实验四、细菌转化 实验五、质粒的小量制备与鉴定 实验六、质粒的大量制备 实验七、原核表达与表达产物的提取 实验八、SDS-PAGE电泳 实验九、病毒基因组DNA的提取
实验三 感受态细胞的制备
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏 2、从大肠杆菌DH5α平板中挑取一个单菌落，转到一个含 50mL LB培养基的盐水瓶中，于37℃ 300转/分剧烈振荡 培养3-4h。为得到有效转化，活细菌数不应超过108细胞 /ml，一般以稍见浑浊为宜。
实验三 感受态细胞的制备ຫໍສະໝຸດ 实验二 外源DNA片段的克隆
三、外源片段或载体酶切产物的回收 制备回收胶，将所有酶切产物上样电泳回收，用12μl ddH2O洗脱。（一般来说，回收后应电泳观察浓度） 四、外源片段与载体的连接
连接体系（不是一成不变的，要根据经验） DNA片段 10μl pET-30a(+) 7μl 10×T4 Ligase buffer 2.0μl T4 Ligase 1.0μl 22℃ 10min或者过夜(Thermo，不同公司的连接酶反应条件不一样）
Arg-Arg-Gln-Met-(PRRSV ORF7)-（TGA）
引物设计注意事项
载体N端有标签，上游引物要对读码框；下游引物要加终止 密码子 载体C端有标签，上游引物要加起始密码子，且考虑是否加 Kozak序列（真核表达系统）；下游引物要对读码框，并且 要去掉基因本身的终止密码子 利用真核表达系统表达分泌蛋白，其信号肽一般添加在载体 的N端；如需要用标签纯化该蛋白，这需将标签添加到该蛋 白的C端，同时去掉基因本身的终止密码子