Chapter2 细胞生物学研究方法

值口径，可以提高介质折射率，香柏油的折射率和载片玻璃的折射率（1.52）相近，光线可 以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是 目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。显微镜的最大有效倍 数为 1000X。
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（发明的人获得物理诺贝尔） 利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察 –A. 当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加 –B. 当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低 相差显微镜 1、特点： 将光程差或相位差转换成振幅差（肉眼可辨） 。 不需要染色 环形光阑（annular diaphragm） ：位于光源与聚光器之间 相位板（annular phaseplate） ：物镜中加了涂有氟化镁的相差板，可将直射光或衍射 光的相位推迟 1/4λ 2、原理： 光线透过不同密度的物质时滞留时间长短不同， 把透过标本的可见光的光程差变成振幅 差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。肉眼能够辨认出来。 3、用途： 可用于观察活细胞，观察未经染色的玻片标本，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动 态。 微分干涉显微镜 利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果。适于研究活细胞中较大的细胞器。
（四）细胞内特异核酸的定位与定性 •原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的 位置
•光镜水平–同位素标记或荧光素标记的探针 •电镜水平–生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合 FISH（Fluorescent In Situ Hybridization)荧光原位杂交
二、电子显微镜技术 1.电子显微镜的基本知识 高分辨率<—电子束作为光源，波长小于 0.1nm ①电磁透镜聚焦②镜筒高度真空③图像通过荧光屏或感光胶片记录
2.电子显微镜的基本构造 ①电子束照明系统（电子枪和聚光镜）②成像系统（物镜、中间镜与投影镜）③真空系统④ 记录系统 3.电镜分辨本领与有效放大倍数 ①电子显微镜分辨率可达 0.2 nm；②电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率 电镜与光镜光路图比较
3.电子显微镜制样技术
应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构 (2)负染色技术:背景染色，衬托出样品的精细结构 ①观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等 ②用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺 上一层重金属盐， 而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。 由于电子密度高的重金属盐包埋了 样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，这样，在图像中背景是 黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染技术。 ③分辨率可达 1.5 nm 左右 (3)冰冻蚀刻技术 包括冰冻断裂和蚀刻复型两步：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层 蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica） ，置于载网 上作电镜观察。 4.扫描电镜技术（Scanning electron microscope, SEM） 观察标本表面结构。 ①分辨率为 6~10nm；②电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次 电子成象；③为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属 膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号；④CO2 临界点干燥法防止引起样品变形的 表面张力问题。 5.扫描隧道显微镜 STM (Scanning tunnel microscope)(发明者诺贝尔) ①探测微观世界物质表面形貌②利用量子力学中的隧道效应③具有原子尺度的高分辨本领
（三）荧光显微镜 Fluorescence Microscope 在光镜水平对特异蛋白质等大分子研究的最有力工具之一。 1.特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；需要特异荧光染料。 2.原理：以紫外线为光源，经滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光 物质发射出荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行物体的形状及其所在位置的观察。 3.结构 荧光显微镜与普通光学显微镜相比较，增加了一些附件：荧光光源、激发光滤片和阻断滤 片。 荧光光源：一般采用超高压汞灯(50-200W) 激发滤片（一般有紫色、蓝色和绿色激发片） ：使一定波长的激发光透过照射到标本上，而 将其他光都过滤掉； 阻断滤光片：1）吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛；2）选择并让特异 的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 免疫荧光技术——两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位。
Formazan，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。用酶标仪测定 OD 值可反映活细胞的 相对数目。 •MTT 法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。 4. 细胞增殖测定：BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)：胸 腺嘧啶核苷类似物 BrdU：需要通过 BrdU 抗体介导的免疫荧光染色 EdU：可以和 Apollo 荧光染料特异性地结合 （二）细胞工程 1. 细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization） •通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 •同核体：相同基因型的细胞融合而成。 •异核体：不同基因型的细胞融合而成。 •自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 •诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 •诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒） 、化学方法（聚 乙二醇 PEG） 、物理方法（电击和激光） 。 2. 单克隆抗体（发明者诺贝尔） 融合后的杂交细胞既能分泌抗体，又能无限增殖。 3. 细胞显微操作技术 micromanipulation technique •显微操作技术是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 •包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术（克隆羊多利）
细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术（light microscopy) ���普通复式光学显微镜（Compound Light Microscope） ���相差显微镜（phase-contrast microscope） ���微分干涉显微镜（differential interference contrast microscope，DIC） ���荧光显微镜（Fluorescence Microscopy） ���激光共焦扫描显微镜（Laser ConfocalMicroscopy） ���活细胞工作站（live cell station）
免疫染色为抗原抗体反应。 绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达。 GFP 成就诺贝尔奖。
荧光显微镜
（四）激光共聚焦扫描显微镜（LCSM）LSCM：Laser confocalscanning microscope ①以激光为光源；②聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像；③利用 激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息， 形成清晰的二维图像； ④分 辨率比普通荧光显微镜高 1.4～1.7 倍 （五）活细胞工作站 Live cell station 计算机辅助的 DIC 显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动 ①采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、DIC、摄影装置于一体；②自动化与电子化。
（一）普通复式光学显微镜 1. 构成 （1）照明系统：光源(普通光线可见光)、折光镜、聚光镜、滤光 （2）光学放大系统：两组玻璃透镜——目镜、物镜 （3）机械装置：保证光学系统的准确配置和灵活调控 2. 原理： 是将两个凸透镜系统适当地组合在仪器上对标本进行放大， 经物镜形成倒立实像， 经目镜放大成虚像。 3. 分辨率：是指区分开两个质点间的最小距离。指分辨物体最小间隔的能力。是显微镜最 重要的性能参数。
D=
������ 2
0.61λ ������ ∙ sin
������ 2
λ 为入射光波长； 数值口径：������ ∙ sin ； N=介质折射率； α =镜口角（样品对物镜镜口的 张角） ，通常最大值可达 140°。 显微镜的分辨率是由入射光波长和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数 值口径可以提高分辨率。可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可提高分辨率。要增加数
（五）定量细胞化学分析与细胞分选技术 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术
用于细胞周期、细胞凋亡的研究。
细胞培养与细胞工程
（一）细胞的培养 1. 几个基本概念: •原代培养（primary culture） ：培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培 养称为传代或传代培养（passage） 。 •细胞系（cell line） ：原代培养细胞成功传代即为细胞系。亚二倍体，接触抑制丧失。 •克隆（clone） ：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细 胞群。 2. 动物细胞培养 •群体培养（mass culture） ：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长， 汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层； •克隆培养（clonalculture） ：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁生长，每一个细胞形成 一个细胞集落，称为克隆。 Eg：HeLa 宫颈癌上皮细胞 from Henrietta Lacks 培养细胞的特性： 培养细胞的生长方式： •贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长，见于各种实体瘤细胞。 •悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于 各种造血系统肿瘤细胞。
Chapter2 细胞生物学研究方法
细胞生物学研究方法：1. 细胞形态结构的观察方法； 2. 细胞组分的分析方法； 3. 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 显微镜的历史：1. SalvinoD’ Armate第一个发明眼镜 2. the Jansen’s将几个透镜在一个长管中组合，放大倍数增大 3.Anton Van Leeuwenhoek（列文虎克）第一个使用显微镜（270*） 4.Robert Hooke 发现细胞，使用原始结构显微镜