细胞生物学研究方法

一、章（节、目）授课计划第页

二、课时教学内容第

技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有

显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技

术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。

细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的

方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:

核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。

第一节细胞形态结构的观察方法

一、有关显微镜的一些概念

（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。

光学显微镜的分辨率 R=λ/N．sin（α/2）．

其中λ为入射光线波长；

N =介质折射率；空气中N =1

α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的

比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。

例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是

100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。

显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。

（3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决

定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的

d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数：

M=d′/d

二、显微镜的分类

现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学

►扫描隧道显微镜(STM)所观察的样品必须具有一定程度的性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则根本无法直接观察。

►在扫描隧道显微镜(STM)的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率较差。

第二节细胞组分的分析方法

形态学观察和细胞成分的分析相结合是当代细胞生物学研究中长采用的试验方法。

一、细胞组分分离技术

►是分离细胞器及各种大分子基本手段。

►转速10~25kr/min的离心机称为高速离心机。

►转速>25kr/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。

超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。

（一）差速离心 Differential centrifugation

►特点：

介质密度均一；

速度由低向高，逐级离心。

►用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。

►沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。

►可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。（二）密度梯度离心

►用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分

离。

►类型：速度沉降、等密度沉降。

►常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。

►分离活细胞的介质要求：

1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；

2）PH中性或易调为中性；

3）浓度大时渗透压不大；

4）对细胞无毒。

1. 速度沉降 velocity sedimentation

►用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。

►特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。

►原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。

2.等密度沉降 isopycnic sedimentation

►用途：分离密度不等的颗粒。

►特点：

介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密

度。

力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。

►原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。

3、四氧化锇:与不饱和脂肪酸反应成黑色，脂肪滴

4、Millon（米伦）反应：氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的络氨酸残基反应，形成红色沉淀，（有色复合物）蛋白质

5、联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。

6、脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。

7、茚三酮反应：显示蛋白质

三、特异蛋白抗原的定位与定性

细胞内蛋白质定位法：免疫荧光技术和免疫电镜技术

蛋白质体外定性法：免疫印迹、放射免疫沉淀、蛋白质芯片和质谱分析（一）免疫荧光技术

根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。

快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。

（二）免疫电镜技术

能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。

免疫铁蛋白技术

免疫酶标技术

免疫胶体金技术

应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等

四、细胞内特异核酸序列的定位和定性

分子杂交技术：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。

►原位杂交（in situ hybridization）。

用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。

五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态