第二章：细胞生物学研究方法 考研细胞生物学辅导讲义

一、显微成像技术

（一）普通光学显微镜

⏹1.构成：

⏹①照明系统

⏹②光学放大系统

⏹③机械装置

⏹2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。⏹3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。

⏹光学显微镜的分辨力R=0.61λ/N．A．

⏹其中λ为入射光线波长；

⏹N．A．为镜口率＝ｎs i nα/2；

⏹n=介质折射率；

⏹α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

2、常用的光学显微镜

⏹（1）普通双筒显微镜有较强的立体感。

⏹（2）荧光显微镜：研究细胞内物质的吸收、运输、及化学物质的分布及定位以紫外为光源。

⏹（3）相差显微镜，观察无色、透明、活细胞中的结构（未经染色的活细胞）产生明暗差异

⏹（4）暗视野显微镜：观察未经染色的活体或胶体粒子适合观察细胞核、线粒体、细菌、霉菌等。

⏹（5）倒置显微镜培养细胞观察03年选择题

倒置显微镜i n v e r s e m i c r o s c o p e

⏹物镜与照明系统颠倒；

⏹用于观察培养的活细

胞，通常具有相差或

D I C物镜，有的还具有

荧光装置。

⏹学习重点：

⏹1.光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括

普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。掌握电子显微镜的原理和样品制备方法，以及和光学显微镜的差别．

⏹２.掌握酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技

术的原理

⏹３.了解细胞培养和细胞融合、细胞生物反应器、染色体转

移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养

⏹4.离心分离技术

⏹这一章每年都有真题出现，大部分以填空，选择和判断的

题型出现，总体看来，题目难度在下降，但是实际应用的能力越来越看重，07、08年就近30分的考题

第二章：细胞生物学研究方法

1. 原理

⏹

以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与 加速电压(通常50~120K V )的平方根成反比；

⏹

由电子照明系统透镜成

像

系统、真

空 录系统、电源系统等5部分构成；⏹ 分辨力0.2n m ，放大倍数可达百万倍；

⏹

用于观察超微结构（小于0.2µm ）。

TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE ，

TEM

2. 制样技术

⏹

1）超薄切片 ⏹ 超薄切片厚度仅50n m 左右，用超薄切片机

（u l t r a m i c r o t o m e ）制作。

⏹ 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，

环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。

4、 电子显微镜

⏹ 由三大部分组成∶电子光学系统(镜筒)、真空

系统、电子学系统(供电系统)。 观察的是亚显微结构

⏹ 电子显微镜的样品也需固定、包埋、切片 （超薄切片，切片放在载网上）、染色等。 采用负染色：只染背景不染样品

⏹ 透射电子显微镜，扫描电子显微镜

3、 光学显微镜的样品制备与观察

⏹ 3.1 样品的固定(f i x a t i o n )：醛类

⏹ 3.2 包埋和切片(e m b e d d i n g a n d s e c t i o n i n g ) 切

片厚度：1-10u m

⏹ 3.3 染色(s t a i n i n g ):有机染料

⏹ 3.4 放射自显影技术

⏹ 断面的三种处理方法： ⏹ 蚀

刻（ e t c h i

n g 蚀刻

（

n

o e t c h i n g

蚀刻（d e e p e t c h i n g ）

tip cell with etching.

培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示Clathrin 衣被

（二）扫描电子显微镜 ⏹ 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构；

⏹

分

辨力为6~10n m ，因人眼的分辨力（区别荧光屏上 距离最近两个光点的能力）为0.2m m ，扫描电镜的 有效放大倍率为0.2m m /10n m =20000X 。 Scanning electron microscope （ SEM ）

3）冰冻蚀刻 f r e e z e -e t c h i n g

⏹

亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将 组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（r e p l i c a ）。

2）负染技术

⏹

电镜观察需要有足

够的反差。用重金属盐(如磷钨酸) 染 色；吸去染料干燥后， 样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5n m 左右。

aine

Archaebact

⏹光学和电子显微镜成像原理

⏹照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素，因为波长决定能被检测样品的最小极限

电子显微镜与光学显微镜的基本区别

二、细胞化学技术

⏹1、酶细胞化学技术

┌────酶的细胞化学反应─────┐

│酶+条件初级捕捉剂│

底物──→反应产物──→最终反应产物

（酶反应）（捕捉反应）

⏹2、免疫细胞化学技术（免疫荧光技术和免疫电镜技术）

⏹3、细胞分选技术

⏹流式细胞计，掌握原理

⏹细胞的分选

⏹染色体的分选

F l o w C y t o m e t r y’s b a s i c s t r u c t u r e

单细胞悬液

真题再现2000年用流式细胞仪分选细胞和染色体，从生物学角度来

看，应该注意的三个关键技术环节 (比较难)

三、细胞工程技术

⏹1

、

细

胞

培

养

*

*

*

7

年

大

题

研

究

方

法

：

体

外

培

养

动

物

细

胞

⏹08大题两道A为研究工作的需要，请你提出建设一间动物细胞培

养室的设计规划，包括培养室的大小、格局、基本设备、经费预算等（10分）

⏹B为了将培养中的单层表皮细胞制备成单细胞悬浮液，通常要添加

E D T A或E G T A，以胰蛋白酶，请问添加这些试剂作用是什

么？（5分）

⏹1

.

1

原

代

培

养

(

p

r

i

m

⏹传代培养（二者区别？？）

⏹1.2细胞系和细胞株(c e l l l i n e a n d c e l l s t r a i n)

⏹1.3动物细胞培养方法

⏹贴壁培养

⏹悬浮培养

⏹1.4植物组织培养(p l a n t t i s s u e c u l t u r e)（可以留意）

⏹1.5植物原生质体培养

（三）激光共聚焦扫描显微境

L a s e r c o n f o c a l s c a n n i n g m i c r o s c o p e,L C S M

⏹用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描；

⏹能显示细胞样品的立体结构；

⏹分辨力是普通光学显微镜的3倍；

⏹用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成

立体图像。

⏹工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面

激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

⏹为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，

要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。