WesternBlot实验详解(--)
Western Blot 实验详解
、实验材料
Western Blot 相关试剂：
甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。
4 C 保存。
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30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水
37 C
溶解，定容至100ml 。
4C 避光保存。
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10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。
分装，-20C 保存。
Western BIot 相关仪器：
电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理
经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该
技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
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2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。
25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。
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10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。
（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。
工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。
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1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。
7g 去离子水溶解，用浓盐酸调至
pH8.8，定容至1L 室温 保存。
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1M Tris-HCl （pH6.8） : Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至
pH7.5，定容至1L
存。
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10X TS （洗膜液）：在 800ml 去离子水，加入 NacI 90g ， 1M Tris-HCl （pH7.5） 100ml ，
水定容至1L 。
工作液：1 X TS 室温保存。
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1M Tris-HCl （pH7.5） ： Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至
存。
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10%SDS :称取十二烷基磺酸钠（SDS ）10g,加入约80ml 去离子水，
调 pH 至 7.2，定容至 100ml 。
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1X Transfer Buffer : 在 1L 大烧杯中加入 800ml 去离子水，加入
pH7.5 ，定容至 1L 室温保
去离子
室温保 68 C 加热溶解。
用10%HCI 3.03g Trisgrams ， 14.43g
三、操作程序与结果判定 操作程序： 一）蛋白样制备 无双抗DMEM （ 10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h 后换含双抗 DMEM （ 10%血清），再过 22h 后处理细胞。
文档收集自网络，仅用于个人学习 吸出培养液，用 PBS 洗1-2次。
每个皿（60mm ）加入200-300UI 细胞裂解液，摇均匀，刮细胞。
（最好处理完一个样品 后再处理另外的样品，不要同时处理 ）文档收集自网络，仅用于个人学习 用一次性 1ml 针筒吸出裂解的细胞液，注入 1.5ml 离心管中，用针筒吸打至清亮。
取 80ul 2 X Sample Buffer 混匀，37 度 30min ，沸水 10min , 1200rpm 10min 取上清， ，上样，剩余样品 -20 度储存。
文档收集自网络，仅用于个人学习 ） SDS-PAGE
制备分离胶 5ml 加入组装好的玻璃板中，立即水封。
（一般配 10%分离胶） 待两液相出现折线，胶凝后将水倒出，加入制备的浓缩胶 3ml 插入梳子，待凝固。
胶凝后拔出梳子，将玻璃板转过来，加入电泳缓冲液。
用针筒吹净每个孔。
上样，通电电泳：浓缩胶电压 90V （约30min ）分离胶120V （约90min ）。
三）转膜（湿转） （100KD 以上 ），小的蛋白片段建议半干转膜。
海绵，滤纸在转膜液中浸泡， PVDF 膜在甲醇中浸泡 2min 。
在玻璃板上铺海绵， 五层滤纸， 用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上， 玻璃 棒赶走气泡，贴上 PVDF 膜，再铺上五层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。
将其整体转 移到转膜夹上。
文档收集自网络，仅用于个人学习 12V 电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。
1. 2. 3. 4。
5。
冰浴， 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 注意：方向应为：阴极-海绵-五层滤纸-胶-PVDF 膜-五层滤纸-海绵-阳极
（四）封膜 1. 配制封膜液，在 20ml 1 X TBST 中加入 1g 脱脂奶粉（一块膜的用量） ，充分混匀倒入保 鲜盒中。
将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下。
摇床上摇 2h 。
2. 3. （五） 一抗 把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上摇 （六） 二抗 1. 2. 4h 。
将一抗回收，放入 -20 度冰箱中。
在保鲜盒内加入 8ml 1 X TBST 摇床10min 3次。
8ml ）,摇床 2h 。
3. 倒掉冲洗液，加入二抗溶液（ （六）洗膜，显影，定影 1.
将二抗回收，放入 -20 度冰箱中。
在保鲜盒内加入 8ml 1XTBST 摇床 10min 3 次。
2. 将A 、B 液按1:1配制，在一试管中各加 400UI 的A 液和B 液。
注明：ECL A 、B 液最好选用Pierce 公司的Super Signal West Picq 国产可选用碧云天的。
文档收集自网络，仅用于个人学习 3. 在工作台上铺好保鲜膜，在保鲜膜上滴一小滴 ECL 混合液，将洗好的膜放上，在膜上 滴 ECL 混合液，盖上保鲜膜，确定无气泡。
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关灯，黑暗中拿出胶片，折起一角，放在膜上，压膜（ 压膜必须带手套，且不能有水,
否则会有非特异性黑斑，压膜时间越长，条带越浓
）。
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将压好的膜放入显影液中在红光下观察膜片上的条带。
用水冲洗，放入定影液中定影，用水冲洗，晾干。
结果判定
四、注意事项
1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。
因此，凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗
原量不至于太低，如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释。
文档
背景过 高
问题 目的蛋 白信号 弱
转膜效 率低
显色或 曝光后 无条带
4. 5.
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形成凝胶的试剂要有足够的纯度 ,激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合的速度
,也
将影响凝胶的质量 ,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。
因此， 建议要根据不同温度 下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为
15-20 分钟最佳 ,对于浓缩胶最佳聚合时间为 8-10 分钟开始可见聚合。
灌完分离胶加水封 闭分离胶与外界氧气的结
合。
文档收集自网络，仅用于个人学习 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性 ,操作时应该戴手套口罩防护。
梳子插入浓缩胶时， 应确 保没有气泡， 可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生， 梳子拔出来时应该小心 ,不要破 坏加样孔，如有加样孔上
的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶 内。
文档收集自网络，仅用于个人学习 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品
,以减少蛋白质带的拖尾现象 。
为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液 上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 。
样品缓冲液中煮沸的样品可在 -20 C 存放数月，但是反复冻融会使蛋白质降解。
为减少蛋白质条带的扩散 ,上样后应尽快
进行电泳，电泳结束后也应尽快转印。
取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记 （如左上角 ）转膜时也应 用同样的方法对 PDVF 膜做上标记 （如左上角 ）以分清正反面和上下关系。
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10. 转膜时应依次放好 PDVF 膜与凝胶所对应的电极 ,即凝胶对应负极 ,PDVF 膜对应正极。
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
9.。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答)
Western Blot详解(原理、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
WesternBlot原理和操作方法（详细）
二：需要的溶液：
裂解液 Laemmli样品缓冲液
三：操作步骤：
1)培养细胞蛋白质样品的制备：
1：胰酶酶解后裂解：
细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。
2：皿上直接裂解：
细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。
3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）
Westernblot实验操作详细步骤
Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备：a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。
b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。
c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
2.蛋白质分离：a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。
b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。
3.蛋白质浓度测定：a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。
b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。
4.准备SDS-凝胶：a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。
b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。
c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。
5.蛋白质电泳：a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。
b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。
c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。
d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。
6.蛋白质转膜：a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。
b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。
7.阻塞和抗体孵育：a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。
b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。
c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。
8.洗涤：a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。
b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。
9.二次抗体孵育：a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。
b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。
10.再洗涤：a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。
b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。
11.信号检测：a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。
b.按照探针供应商的说明进行操作。
Western-Blot过程步骤详解中英文对照
实验四蛋白质印迹分析【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。
【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。
值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。
经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常用的两种电转移方法分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。
2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。
由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。
对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。
【实验材料】1. 实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜（Millipore Immobion-P #IPVH 000 10）；Whatman 3MM 纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。
2. 实验试剂⑴ 10x转移缓冲溶液（1L）：30.3g Trizma base(0.25M), 144 g甘氨酸(1.92M),加蒸馏水至1L, 此时pH约为8.3，不必调整。
WesternBlot详解及问题分析
缓冲液PH
pH6.8TrisCl
pH8.8TrisCl
凝胶浓度
低，2-5%
高，根据蛋 白大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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灌制积层胶 插入梳子
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Staking gel Separating gel
原 • 膜没有因均匀浸湿
• 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿
• 膜或者缓冲液污染 • 封闭不充分
• 拿取膜与吸水纸时要戴手
对
套，更换新鲜转膜缓冲液
• 抗体与封闭剂出现交 策 • 检测一抗、二抗与封闭剂
叉反应
是否有交叉反应
• 抗体浓度过高
• 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
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杂交信号很弱
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入AP和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部
分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 ➢ 两块玻璃板底部要对齐
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SDS-PAGE电泳
条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提 取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
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蛋白样品的定量
➢ 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
生化实验九 Western_blot的原理、操作
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。