植物激素的测定方法
植物激素免疫测定指南
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。
由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。
目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。
植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。
直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。
间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。
间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。
根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。
材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。
3 试剂(1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。
植物激素的测定方法
植物激素的测定方法植物激素是一类由植物自身合成并参与生长发育调控的活性物质，对植物的生长发育起着重要作用。
因此，准确测定植物激素的含量对于研究植物生长发育调控机制具有重要意义。
本文将介绍几种常用的植物激素测定方法。
一、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是目前应用最广泛的植物激素测定方法之一。
该方法基于植物激素在高效液相色谱柱上的保留时间和峰面积，通过与已知浓度的标准品比较，可以计算出待测样品中植物激素的含量。
高效液相色谱法具有分离效果好、分析速度快、准确度高的优点，但需要专用的仪器设备，操作较为复杂。
二、气相色谱法（GC）气相色谱法是另一种常用的植物激素测定方法。
该方法通过将待测样品中的植物激素转化为易挥发的衍生物，然后在气相色谱柱上进行分离和定量分析。
气相色谱法具有测定灵敏度高、分离效果好的特点，但需要对样品进行预处理，并且对仪器的稳定性要求较高。
三、酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学测定方法，也可以用于测定植物激素的含量。
该方法通过将植物激素与特异性抗体结合，然后再用酶标记的二抗进行检测，最后通过比色反应或发光反应来测定植物激素的含量。
酶联免疫吸附法具有操作简便、成本较低的优点，但需要特异性较好的抗体。
四、放射免疫测定法（RIA）放射免疫测定法是一种使用放射性同位素标记的植物激素进行测定的方法。
该方法通过将放射性同位素标记的植物激素与待测样品中的植物激素结合，然后通过放射性计数来测定植物激素的含量。
放射免疫测定法具有灵敏度高、测定范围广的特点，但需要使用放射性同位素，存在辐射危险。
五、质谱法（MS）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可以用于测定微量的植物激素。
该方法通过将待测样品中的植物激素通过质谱仪进行分子质量分析，从而测定植物激素的含量。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率的特点，但需要专用的仪器设备和较高的技术水平。
植物激素测定方法有高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法和质谱法等。
植物激素检测方法
植物激素检测方法一、什么是植物激素？植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程，既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。
通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质。
植物激素主要包括生长素(auxin)、赤霉素(gibberellin，GA)、细胞分裂素(cytokinin，CTK)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、油菜素甾醇类(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(MeJA)、水杨酸类(salicylic acids，SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素(peptide hormones)等。
二、检测方法科标生物检测中心可以提供各种植物样品检测服务，中心是通过权威认证的第三方机构，检测后出具权威检测报告。
三、主要分析技术1、生物鉴定法是一类经典的植物激素检测方法，它利用激素作用于植物的组织或器官时产生的特异性反应对植物激素进行测定。
2、免疫检测技术是测定植物激素的常用方法。
该方法是基于抗原和抗体的特异性结合，因此有较好的专一性。
采用放射性元素标记的方法，即放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，其检测灵敏度高，重复性好，但对实验条件的要求较高。
3、气相色谱火焰离子化检测法(GC-FID)和气相色谱质谱法(GC-MS)能够对所分析样品进行准确、高灵敏度测量，但由于气相色谱对样品的特殊要求，使得待测组分需具有一定挥发性，因此在植物激素样品的前处理过程中需对样品进行衍生化。
4、高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FL)和高效液相色谱质谱检测法(HPLC-MS)也大量用于植物激素的纯化及定量分析，其中MS因为具有良好的选择性和灵敏度，并且能够给出化合物的结构信息，在实际检测中得到了更普遍的运用。
植物激素(Plant_hormones)
2．物理和化学方法 植物激素的测定分析采用薄层层析、气相
色谱（gas chromatography，GC）、高效液相层析（high liquid performance chromatography，HPLC）、质谱分析（mass spectrography，MS）等，其原理大都是基于不同物质在不同介质中 的分配系数。测定生长素含量可以达到10-12g的水平。如GC测定乙 烯含量；气质联谱（GC-MS）分析赤霉素。
二、植物激素的种类及相互之间的作用 目前公认的植物激素有五大类： 生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、乙烯、脱落酸。 植物体内存在油菜甾体类（BR）、多胺（PA）、茉莉酸 （MJ）、水杨酸（SA）、寡糖素等也具有近似激素的特性。 我国科学家发现玉米赤烯酮等 起初人们认为某一种植物生理作用具有专一性。例如生长素 促进细胞体积扩大；赤霉素促进茎伸长生长；细胞分裂素促 进细胞分裂；脱落酸促进休眠以及乙烯促进果实成熟等。后 来发现上述每一种生理现象的控制因素极为复杂，不是一种 激素起一种作用，是各种激素之间相互作用的综合表现。
2.
不同激素间的拮抗作用
不同激素间的拮抗作用，生长素与细胞分裂素对植物顶端优势有 相反的效应，生长素与乙烯对叶片脱落也有相反的作用，脱落酸对生 长素、赤霉素或细胞分裂素的生理作用也有分别的拮抗作用。
3. 某种激素通过影响其它激素的合成、运输及代谢而改 变后者浓度。
生长素提高乙烯：较高浓度的生长素对植物体内乙烯合成有显著的 促进作用，生长素提高乙烯合成效率，乙烯抑制生长素在植物体内运 输并影响生长素的代谢。 GA与生长素：GA抑制生长素结合态的形成及氧化酶的活性，从而提 高生长素的浓度；赤霉素则能促进生长素的生物合成作用。
激素特点： ①产生于植物体内特定部位，是植物正常生长发育过程中或特殊环境下 的代谢产物；
植物激素的提取和纯化
植物激素测定的方法
1、生物测定法
生物测定法是通过测定激素作用于植株或离体器官后所产生的生 理生化效应的强度，从而推算植物激素含量的方法。
特点：简单易操作，但是其灵敏度及专一性均不够高 。
2、物理和化学方法
薄层层析、气相色谱(GC)、高效液相层析(HPLC)和质谱分析(MS)、 色质联谱(GC-MS)可以更为精确地检测多种激素 。
实验步骤
• 1、植物激素的提取：
分次加入3ml 80%甲醇 称样（0.5g） 10000g 倒入离心管 10min 离心
研磨 倒出上清液
• 2、激素的纯化：过C18柱法
5ml针筒接在C18柱上 5ml 100%甲醇 5ml 70%甲醇
5ml乙醚
加样ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 3、取出300μl氮气吹干备用。
实验5 植物激素的提取和纯化
一般激素在植物中的含量极低，性质又不稳定，加 之细胞中其他化合物的干扰，故测定的方法必须 十分灵敏和专一。通常首先用合适的有机溶剂来 提取，既要避免许多干扰物质，又要防止破坏激 素本身。其次采用各种过柱、萃取或层析步骤， 使激素得到部分提纯。然后再用生物的、物理的 或化学的方法测定其含量。
特点：灵敏度和选择性高，重复性好，但对前处理要求较高 。
3、免疫分析法
放射免疫检测法(RIA)和酶联免疫吸附检测法(ELISA)是当前常用的两 种激素定量技术。
特点：高专一性，高灵敏性，操作简便，样品往往只需初步纯 化。
实验材料、试剂和仪器
• 1、实验材料：新鲜采集的叶片或其他部分； • 2、试剂：80%甲醇； • 3、仪器：研钵、移液抢、塑料离心管、高速低温 离心机、Sep-Pak C18柱、吹氮气装置。
植物激素的测定方法-精品文档
二、免疫球蛋白的分子结构
免疫球蛋白的基本结构
• 四肽链结构 ，链间二硫键连接 • 两条重链（H）和两条轻链（L） • 氨基端和羧基端。
可变区与恒定区
• 根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C） • 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较 大 • 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序 及 含糖量都比较稳定
注意事项 ：
（ 1 ）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。 （ 2 ）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。 （3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （ 4 ）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
测定标准物各浓度和各样品490nm
处的OD值。
数据分析
在波长 450nm 处分别读取各标准孔和样本孔 OD 值， 以 OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐
用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的
利用反对数求得ABA的绝对含量。
OD值在标准曲线上查出待测样品的 ABA含量的对数。
植物激素的酶连免疫分析法
几种酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
操作步骤
包被---温育---洗涤---竞争--温育---洗涤---加二抗---温育--
-洗涤---显色---比色---计算
包 被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后
植物激素的测定方法？
生物活性法 气相色谱（气-质联机） 液相色谱（液-质联机） 酶连免疫法（ ELISA 法）
植物激素的检测方法
比色谱法是最早应用于生长 素分析的光谱法，但由于该法选 择性差，现很少被应用。荧光分 析法是进行痕量、超痕量甚至分 子水平上分析的重要手段，它具 有选择性好、取样少、灵敏度高 以及简便快速等优点，近年来在 植物激素分析中得到广泛应用。
电化学分析法
电化学分析法相对于气相色谱(GC)、液相色 谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、免疫法等分析方法具 有简单、方便和仪器价廉等特点. 在早期的研究中, 植物激素的电化学分析方法主要是针对脱落酸、赤 霉素、玉米素和激动素等植物激素标准品的电化学 行为进行探讨. 通过研究发现, 植物激素存在的本底 溶液的性质和pH 对测定结果会产生很大影响。
色谱法和光谱法
色谱法
光谱法
色谱学是利用物质在不同介质中的 分配原理进行测定的, 包括纸上层析、薄 层层析( TLC)、气相色谱( GC)、高效相 色谱( HPLC) 以及气质联用( GC-M S) 等, 将分离和测定结合起来是色谱法的基本 特点。根据色谱学理论, 某种化合物在一 定色谱条件下的出峰时间(保留时间) 是 固定的, 这是色谱学定性的依据； 而色 谱峰面积(或峰高) 与物质的含量(或总量) 成正比, 这是色谱学定量的基础。
植物激素 的 检测方法
目录
CONTENTS
01
02
03
04
植物 激素 定义
植物 激素 分类
植物 激素 检测 方法
参考 文献
1
植物激素的定义
植物激素的定义
天然植物激素或内源性植物激素, 是植 物自身代谢产生的一类具有高度生物活 性的有机小分子化合物. 它们一般先在 植物的某一部位合成, 然后再转运到其 他部位去发挥作用。植物激素虽是小分 子, 却调控着几乎整个植物生命周期, 如 种子萌发、茎叶伸长、果实成熟以及脱 落等生理过程。植物激素还能感应植物 所处生存环境的外界刺激, 如水分、光 照、温度和损伤等, 并作出相应的反应。
酶联免疫法(ELISA)测定植物激素含量
酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量姓名：李希东专业：植物学学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：一、实验目的：掌握间接法测定植物激素的原理和方法；了解逆境对玉米根系ABA和IAA含量的影响。
二、实验原理：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。
其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。
ELISA把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。
间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。
如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。
图A表示间接酶联免疫方法的基本原理：A.间接酶联免疫原理示意图示反应板（固相载体）示激素特异抗体（一抗）示激素（抗原）示非特异二抗示蛋白质·激素复合物示标记酶本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:Ab十H十HP=AbH十AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
加 抗体
➢在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加 50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。
➢竞争条件37℃左右0.5h。
洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
加“二抗”
将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释 液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混 匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入 湿盒内，置37℃下，温育0.5h。
4、制备生物导弹用于肿瘤、 移植等的临床治疗。
六、人工制备的抗体
• 多克隆抗体：多个抗原决定基——机体—— 多种抗体的混合物
• 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）：由一个B细胞克隆产生的、针对 某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体
• 基因工程抗体
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免 疫学诊断的敏感性
植物激素的酶连免疫分析法
几种酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602 标配酶标分析仪
操作步骤
包被---温育---洗涤---竞争--温育---洗涤---加二抗---温育--洗涤---显色---比色---计算
包被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后 将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷 盘内。
间接ELISA
双抗夹心法
放射性同位素：
125I、131I 酶：辣根过氧化物 酶、硷性磷酸酶
荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄 绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹 明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA） 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）
酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA法）
（2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精 密 度 差 （ 批 内 CV15-20% ） ； 线 性 范 围 窄 （一个数量级）。
注意事项 ：
（1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。
（2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。
洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
加底物显色
在每孔中加100μl 邻苯二胺（OPD）溶液 （小心勿用手接触OPD），（每10ml溶液中 含4μl 30% H202。混匀，然后放入湿盒内， 当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色 梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加 入50μl 2mol/L硫酸终止反应。
• 完全抗原
半抗原
+
(complete antigen)
• 半抗原(hapten)
• 载体(carrier)
载体
完全抗原
B B
B
BT T
抗体
抗体（Ab）
一、基本概念：
• 抗体（antibody,Ab)是B细胞识别抗原后增 殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要 存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性 地结合，具有免疫功能。
（3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
原理（以间接性ELISA为例）：
显色
抗原医学上Leabharlann 要的抗原伤寒杆菌链球菌
痢疾杆菌
• 37 ℃下1.5小时。
洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
竞争
➢ 即加标准物、待测样和抗体。 ➢ 加标样及待测样： 取适量所给标样稀释配成： ABA
标准曲线的最大浓度为100ng/ml,然后再依次2倍稀 释8个浓度（包括2个0ng/ml，加入前两行的最后两 排 ）。将系列标准样加入96孔酶标板的1、2、3行， 每个浓度加3孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个 样品重复3孔，每孔50μl。
狂犬病病毒
口蹄疫病毒
流感病毒
抗原的概述
• 抗原（Ag）是指能与淋巴细胞抗原受体 特异性结合，刺激机体免疫系统产生特 异性免疫应答，并能与相应免疫应答产 物在体内、外发生特异性反应的物质
• 抗原的两个基本特性
– 免疫原性（immunogenicity) – 免疫反应性 (immunoreactivity)
比色
在酶联免疫分光光度计上依次 测定标准物各浓度和各样品490nm 处的OD值。
数据分析
用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔， 在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值， 以OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐 标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的 OD值在标准曲线上查出待测样品的ABA含量的对数。 利用反对数求得ABA的绝对含量。
植物激素的测定方法？
➢生物活性法 ➢气相色谱（气-质联机） ➢液相色谱（液-质联机） ➢酶连免疫法（ ELISA 法）
问题：我们该选择哪种板呢？
ELISA技术的特点与局限性
（1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性 物质形成"免疫吸附剂"；酶标记免疫活性物 质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗 涤过程；灵敏度特异性相对较高。
• 免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指 具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋 白
二、免疫球蛋白的分子结构
免疫球蛋白的基本结构
• 四肽链结构 ，链间二硫键连接 • 两条重链（H）和两条轻链（L） • 氨基端和羧基端。
可变区与恒定区
• 根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C）
• 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较 大
• 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序 及 含糖量都比较稳定
单克隆和多克隆抗体的比较和用途
特异性 敏感性 均一性
PcAb 低
差
无
McAb 高
强
有
1、用于免疫学检测，辅助临 床诊断
2、McAb用于亲和层析，分 离微量可溶性抗原
3、标记的McAb用于基础研 究，了解细胞分化等