食品酶学课件本(第四章固定化酶)
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固定化酶技术ppt课件
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
7
3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
9
1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
11
3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
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1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
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3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
固定化酶的制备和应用 PPT课件
学习探究区
第8课时
(2)方法步骤
①乳糖酶的溶解：准确称取乳糖酶 100 mg，然后将其溶
本
解在 pH__7_.3__的磷酸缓冲液中，其中单体__A_r_c__浓度为
课 栏
质量分数 20%，交联剂__B_i_s __浓度为质量分数 5%。
目 开 关
②聚合：将含有 N，N，N′，N′－四甲基乙二胺和 _过__硫__酸__铵___的磷酸缓冲液迅速倒入乳糖酶的溶解液中，
本 4．固定化酶应用的常见方式
课 栏
(1)间歇式：每次反应完后，经_离__心__或__过__滤___法
目
收集酶后再重复利用。
开 关
(2)连续式：用固定化酶制成的_反__应__柱___进行不
间断的重复利用，如图。
图中①是反应柱，②是固定化酶，③是分布着
小孔的筛板，不允许酶颗粒通过，而反应液可
以自由流出。
加酶分解是用预先灭过菌的玻璃棒每隔一段时间轻轻搅
拌；固定化酶回收用的是缓冲液反复冲洗固定化酶。所
以 C 正确。 答案 C
学习探究区
第8课时
3．下列关于牛奶中乳糖的分解的检测的相关叙述，错误的是( B ) A．乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖
B．还原糖可与双缩脲试剂反应产生砖红色沉淀
本 C．根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性
2．方法步骤 (1)鲜牛奶的处理：取新鲜牛奶 0.5 kg 放入 1 000 mL 干净 烧杯中，__8_5_～__9_0__ ℃巴氏灭菌。将灭菌后的牛奶冷却至 __4_5_～__5_0___ ℃，_过__滤___后平均分为两部分，一部分放入 A 烧杯，另一部分放到 B 烧杯内作对照。
学习探究区
第8课时
固定化酶
⑵ 醚化，先把SESA以1：2的水浸泡，在 40℃时用1M Na2CO3调pH为6.5，除去渣， 以SESA：纤维素=1：1（干重）在pH13， 85℃，醚化30min，即得到ABSE-纤维素。
A．重氮法
⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无 色）
⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应 15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。
举例：
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和 马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%； 用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存 活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在 40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一 条件下存在100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化 有时活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应 20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸 缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时， 过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白 酶（冻干保存）
5． 底物特异性变化
A．重氮法
⑶ 去除多余的苯胺基(用0.5 M NaOH洗三次，水洗至无 色）
⑷ 重氮化盐制备。用5% NaNO2及1MHCl在10℃以下反应 15min，然后用预先冷却的0.05M HCl及H2O洗涤抽干即 成。
举例：
链霉蛋白酶55℃，120min全失活；用乙烯和 马来酸酐聚合物固定化后，相同条件下存活30%； 用溴化氰活化的纤维素固定化后，相同条件下存 活50%。
用DEAE -纤维素通过离子结合固定化转化酶在 40℃下加热 30min活力仅存4%，而游离酶在同一 条件下存在100%。
固定化酶（细胞）热稳定性变化(延胡索酸酶，千烟一郎)
1） 分配效应 2） 空间障碍效应 3） 扩散限制效应
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液 称为宏观环境。
二．固定化后酶性质的变化-酶活性的影响
活力变化的原因：
1、酶分子在固定化过程中，空间构像可能发生了变化 有时活性中心的氨基酸也会参加反应。
2、固定化后的空间障碍效应的影响。 3、内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受
⑶ 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应 20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶
(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸 缓冲液（内含250-500mg酶），5℃搅拌2-3小时， 过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白 酶（冻干保存）
5． 底物特异性变化
《酶的固定化》课件
稳定性等
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
第四章固定化酶ppt讲解
随着固定化技术的发展，也可采用含酶菌体 或菌体碎片进行固定化，直接应用菌体或菌 体碎片中的酶或酶系进行催化反应，这称之 为固定化菌体或称固定化死细胞。
1973年，日本首次在工业上成功地应用固定 化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁 烯二酸连续生产L—天门冬氨酸。
固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用为目 的，它们的制备和应用方法也基本相同
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期 出现了固定化细胞技术。固定化细胞是指固定在载体 上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称 为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤 酒和酒精。1978年，日本用固定化枯草杆菌 细胞生产α-淀粉酶的研究成功，开始了用 固定化细胞生产酶的先例。
玉米淀粉 → 液化、糖化 → 葡萄糖浆 → 膜 过滤 → 离交、浓缩 → 异构化 → 部分变成 果糖（42%）→混合 →浓缩、精制→ 55% 高果糖浆 参与的酶： α—淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶 葡萄糖异构酶
淀粉酶能将淀粉水解为葡萄糖吗?
固定化菌体
用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分 高纯化后的酶。
这一发现是酶的推广应用的转折点，也是酶工程发展的转折点。在此基 础上，酶的固定化技术日新月异。
60年代后期，固定化技术迅速发展。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业 生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶 应用史上的一大变革。
此后，固定化技术迅速发展，促使酶 工程作为一个独立的学科从发酵工程 中脱颖而出。
缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活 固定化酶活力回收率低，且不适合用于 高分子质量的底物。
高果糖浆
也称果葡糖浆或异构糖浆，它是 以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡 萄糖异构酶的异构作用，将其中一部 分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果 糖而组成的一种混合糖糖浆。
1973年，日本首次在工业上成功地应用固定 化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁 烯二酸连续生产L—天门冬氨酸。
固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用为目 的，它们的制备和应用方法也基本相同
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期 出现了固定化细胞技术。固定化细胞是指固定在载体 上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称 为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤 酒和酒精。1978年，日本用固定化枯草杆菌 细胞生产α-淀粉酶的研究成功，开始了用 固定化细胞生产酶的先例。
玉米淀粉 → 液化、糖化 → 葡萄糖浆 → 膜 过滤 → 离交、浓缩 → 异构化 → 部分变成 果糖（42%）→混合 →浓缩、精制→ 55% 高果糖浆 参与的酶： α—淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶 葡萄糖异构酶
淀粉酶能将淀粉水解为葡萄糖吗?
固定化菌体
用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分 高纯化后的酶。
这一发现是酶的推广应用的转折点，也是酶工程发展的转折点。在此基 础上，酶的固定化技术日新月异。
60年代后期，固定化技术迅速发展。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业 生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶 应用史上的一大变革。
此后，固定化技术迅速发展，促使酶 工程作为一个独立的学科从发酵工程 中脱颖而出。
缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活 固定化酶活力回收率低，且不适合用于 高分子质量的底物。
高果糖浆
也称果葡糖浆或异构糖浆，它是 以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡 萄糖异构酶的异构作用，将其中一部 分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果 糖而组成的一种混合糖糖浆。
《固定化酶》PPT课件 (2)
包埋法
网格法 微囊法
化学结合法
交联法 共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
• 是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
• 选择载体的原则
①要有巨大的比表面积
② 要有活泼的表面 ③ 便于装柱进行连续反应。
常用的载体有：
• (1)有机载体： • 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。
第三章
酶的固定化
• 第一节 酶的固定化 • 第二节 辅酶的固定方法 • 第三节 固定化细胞 • 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 • 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
• 绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
• 特点:
它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到 高聚物上。
缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调 整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
• 海藻酸钠
它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al 3+凝胶化 ，操作简单经济。
• K-角叉莱胶（卡拉胶）
• 卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜；Cawageen)中提取的一种多糖。
可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。 包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化 的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好 。
(2)微囊化包埋法
➢微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微 囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。
➢胶囊和脂质体主要用于医学治疗； 中空纤维主要适于工业使用 。
➢主要包括
（1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）脂质体包埋法
酶的固定化ppt课件
b．将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝中，或将 植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 (2)固定化细胞的优点 ①固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，可以像 游离的细胞一样用于发酵生产。 ②固定化细胞技术免去了破碎细胞提取酶等步骤，能充分 利用细胞内的酶，因而，固定化细胞内酶的活性基本没有 损失。 ③保留了细胞内原有的多酶系统，对于多步催化的连续反 应优势就更加明显。
2．用固定化酵母细胞发酵(应用) (1)将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次。 (2)将150 mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200 mL 的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25 ℃下发酵 24 h，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒香。
【巩固2】 酶固定化技术与细胞固定化技术的关系是 ( )。 A．酶固定化技术是细胞固定化技术的基础 B．细胞固定化技术是酶固定化技术的基础 C．酶固定化技术与细胞固定化技术是同时发展起来的 D．细胞固定化技术先于酶固定化技术
C．包埋法
D．交联法
答案 B
2． 固定化细胞常用包埋法固定化，原因是
( )。
A．包埋法固定化操作最简便
B．包埋法对酶活性的影响最小
C．包埋法固定化具有普遍性
D．细胞体积大，难以被吸附或结合
解析 因为细胞个大，而酶分子很小，个大的细胞难以被
吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
答案 D
3． 根据酵母细胞固定化技术，回答下列有关问题。 (1)酵母细胞的活化：向干酵母中加入________，使其恢复 正常的________。 (2)配制CaCl2溶液。 (3)配制海藻酸钠溶液。在加热时要用______或______。 (4)________溶液与________混合。 (5)固定化酵母细胞。 (6)用固定化酵母细胞发酵：将凝胶珠加入用于发酵的 ________溶液后，发现有________产生，同时有________ 味散发。 答案 (1)蒸馏水 生活状态 (3)小火 间断加热 (4)海藻酸钠 酵母细胞 (6)葡萄糖 气泡 酒
固定化酶ppt课件
载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 11
产物性质对固定化酶体系pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低
12
4． 最适温度变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
9
3． 最适pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物
不能结合或结合后不能生成产物。
10
载体对固定化酶体系pH的影响
载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主 体溶液称为宏观环境。
酶
60
酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
61
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
感应电极
酶电极示意图
ß－D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O 69
葡萄糖氧化酶
葡萄糖＋醌＋H2O
葡萄糖酸＋氢醌
Pt
氢醌
醌＋2H＋＋2e－
铂电极
70
（2）脲电极 Urea + 2H2O
脲酶
2NH4++2HCO3-
产生的2NH4+为阳离子电极感应。
产物性质对固定化酶体系pH的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 酶的pH值高；反之则低
12
4． 最适温度变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5． 底物特异性变化
作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化
既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
9
3． 最适pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物
不能结合或结合后不能生成产物。
10
载体对固定化酶体系pH的影响
载体带负电荷，pH向碱性方向移动。
微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主 体溶液称为宏观环境。
酶
60
酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
61
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
感应电极
酶电极示意图
ß－D－葡萄糖＋O2
D－葡萄糖酸－1，5－内酯＋H2O 69
葡萄糖氧化酶
葡萄糖＋醌＋H2O
葡萄糖酸＋氢醌
Pt
氢醌
醌＋2H＋＋2e－
铂电极
70
（2）脲电极 Urea + 2H2O
脲酶
2NH4++2HCO3-
产生的2NH4+为阳离子电极感应。
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3/10/2021
食品酶学课件本(第四章固定化酶)
2
固定化酶示意图
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
3/10/2021
食品酶学课件本(第四章固定化酶)
3
二、固定化技术的兴起与发展
（一）生物催化剂—酶的显著优点 （二）游离酶的不足之处 （三）固定化酶的发展简史
3/10/2021
分类：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为： ①凝胶包埋法 ②半透膜包埋法 特点：优点是条件温和，缺点是只适于底物和产物
都是小分子的酶的固定化。
3/10/2021
食品酶学课件本(第四章固定化酶)
11
①凝胶包埋法
概念：凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶
内部的微孔中而使酶固定化的方法。由于该方法是 将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也称为截 留法。
④1971年，召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定化 酶的统一英文名为Immobilized Enzyme。
⑤1973年，千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞连续化生
产L—天冬氨酸，后来又发展到固定化增殖细胞即固定化活
细胞。 3/10/2021
食品酶学课件本(第四章固定化酶)
7
三、酶和菌体的固定化方法
凝胶种类：所用的凝胶可分为天然凝胶和合成凝胶
两类。前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡
拉胶、明胶等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联
树脂等。
3/10/2021
食品酶学课件本(第四章固定化酶)
12
②半透膜包埋法
半透膜包埋法是指将酶包埋在由各种高分 子聚合形成的小球内的方法。由于半透膜 包埋法所形成的固定化酶小球的直径一般
（3）终产品的分离提纯困难。由于酶反应后成为杂质与产 物混在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。针 对酶的以上不足，改善的方法之一就是固定化技术的应用。
3/10/2021
食品酶学课件本(第四章固定化酶)
6
（三）固定化酶的发展简史
①1916年Nelson和Griffin就曾经将转化酶吸附在炭和氧化 铝上，并且证明这种吸附的酶（即固定化酶）具有活性。
菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法。 吸附剂：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶
瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 特点：最大的优点是廉价简便、条件温和酶活损失
少；最大的缺点是酶易从载体上解吸附。
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（二）包埋法
概念：包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在各种多孔 载体中而使酶固定化的方法。
第四章 固定化酶
一、固定化酶的概念 二、固定化技术的兴起与发展 三、酶和菌体的固定化方法 四、固定化酶的特性 复习题
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一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定空间范围内进行催化 反应的酶。示意图
酶的固定化是指通过某种方式将酶和水不溶性载体相结合， 使酶被集中和限制，从而在使用时不再扩散。固定化酶具 有稳定性增加、可反复使用并易于和产物分开等优点，克 服了游离酶的不足之处。
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②共价键结合法
载体：常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲 壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。
主要步骤：首先在载体上引入一活泼基团使载体活化，然后 使该活泼基团与酶分子中的某一基团反应，形成共价键。酶 分子中可以形成共价键的基团有氨基、羧基、巯基、羟基、 酚基和咪唑基等。
固定化所用的酶可以是经提取分离后得到的一定纯度的酶， 也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。 相应地，前者称为固定化酶，后者称为固定化菌体或固定 化死细胞。可见，固定化菌体是固定化酶的一种形式，它 不像固定化活细胞（或称固定化增殖细胞）那样，固定化
菌体的细胞为死细胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。
只有几微米到几百微米，称为微胶囊，所
以，半透膜包埋法也称为微胶囊包埋法。
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（三）结合法
概念：结合法是指通过离子键或共价键将
酶与载体结合在一起而使酶固定化的方法。
分类：①离子键结合法
②共价键结合法
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（一）吸附法 （二）包埋法 （三）结合法 （四）交联法 （五）热处理法 各固定方法的0/2021
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酶固定化方法示意图 食品酶学课件本(第四章固定化酶)
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（一）吸附法
概念：吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或含酶
②1953年，Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为 载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白
酶、核糖核酸酶等结合，制成了固定化酶。
③1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化 氨基酰化酶从DL—氨基酸连续生产L—氨基酸，生产成本仅
为游离酶生产成本的60%左右，他开创了固定化酶应用于连 续化工业生产的先例，是酶应用史上的伟大变革。
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①离子键结合法
载 体 ： 常 用 的 载 体 有 DEAE— 纤 维 素 、 TEAE— 纤 维 素 、 DEAE— 葡 聚 糖 凝 胶 等 离 子 交换剂。
特点：与吸附法相似，具有酶活损失少、 结合力弱等特点，在pH值和离子强度等条 件改变时，酶易解吸，所以使用时需要严 格控制pH值和离子强度等条件。
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（二）游离酶的不足之处
（1）酶的稳定性差，这是酶的最大的弱点。酶的化学本质 是蛋白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失活。
（2）难于连续化生产。酶一般都是在水溶液中催化反应， 与底物和产物混合在反应系统中，反应后酶仍有较高的活力 却不易回收利用。这种一次性使用酶的方式，导致成本较高 和难以连续化生产。
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（一）生物催化剂—酶的显著优点
酶是生物催化剂，它具有特异、高效、反应条件 温和、副反应少等显著优点，因而随着酶学研究
的不断深入和酶工程的发展，工业化生产的酶越 来越多，酶的应用也越来越广泛。现在酶在食品、 化工、医药、农业、环保、能源和科研等各个领 域已取得了显著的成效。酶作为生物催化剂的许 多优点是任何无机催化剂无法比拟的。