酶的固定化和固定化酶反应动力学
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酶促反应动力学
谢 谢 大 家
2.1.3 酶和细胞的固定化技术
一、固定化技术的基本概念 二、固定化酶的特性 三、固定化细胞的特性 四、酶和细胞的固定化技术
2.1.4 酶促反应的特征
一、优点： • 常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应； • 与一些化学反应相比，省能且效率较高； • 专一性好； • 反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制等。 二、不足， • 多限于一步或几步较简单的生化反应过程； • 一般周期较长。
2.2
均相系酶促反应动力学
2.2.1 酶促反应动力学基础 一、零级反应
dS rm a x dt
二、一级反应——即酶催化A→B的过程
db k1 (a0 b) dt
三、二级反应，即A + B → C
dc k 2 (a0 c)(b0 c) dt
k`1 k2 • 对于连锁反应，如， A B C
1、底物浓度S 远大于酶的浓度efree ，因此x的
形成不会降低底物浓度S ，底物浓度以初始浓 度计算。 2、不考虑P + E → ES这个可逆反应的存在。要 忽略这一反应，必须是产物P为零，换言之， 该方程适用于反应的初始状态。 3、ES → E + P是整个反应的限速阶段，也就是 说E + S = ES的可逆反应在初速度测定时间内 已达到平衡。ES分解生成产物的速度不足以破 坏这个平衡。
k 2 e S r p,max S r p (rs ) Km S Km S
在实际的酶促反应中，人们关心的是反应时间与 底物转化率的关系．所以，基于t=0，S=S0初值积 分得
rmax
S0 t (S 0 S t ) K m ln St
Km S0 1 t ln( ) s rmax 1 s rmax
酶工程第10章固定化酶催化的动力学特征)
如果固定化酶的动力学仍服从米氏方程，则可 通过米氏常数Km值的大小来反映酶在固定化前后 活性的变化。
一些酶在溶液中和固定化后的米氏常数值
酶
底物
固定化试剂
肌酸激酶 乳酸脱氢酶 α－糜蛋白酶 无花果蛋白酶 胰蛋白酶
ATP NADH N-乙酰酪氨酸乙酯 N-苯酰精氨酸乙酯 苯酰精氨酰胺
无（溶液酶） 对氨苯基纤维素
当 Da <<1时，酶催化的最大反应速度要大大 慢于底物的传质速率，此时该反应过程由反应动 力学控制；当 Da>>1时，底物的传质速率大大慢 于酶催化的最大反应速度，此时该反应过程由传 质扩散控制。
外扩散限制效应
（2）作图法求[S]i值和Vi值
根据 Vm[S]i
Km [S]i
kLa ([S]0
[S ]0
[S]0 [S]0
外扩散限制效应
引入 [S] [S]i ， K K m ，并定义 Da Vm ，
[S ]0
[S ]0
k L a [S ]0
[S ]i
Vm [S]0 1 [S]i
kLa [S]0 K m [S]i
[S ]0
[S]0 [S]0
Da [S] 1 [S] K [S]
Viห้องสมุดไป่ตู้
Vm [S ]0 Km [S]0
V0
在这种情况下，酶反应速度不受传质速率的 影响，为该酶的本征反应速度，或称在此条件下 可能达到的最大反应速度，用V0表示。
外扩散限制效应
当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应 速度很快，此时传质速率成为限制步骤。固定化 酶外表面上的底物浓度趋于零，有
Vi k L a[S ]0 Vd max
kLa ([S]0
[S]i )
一些酶在溶液中和固定化后的米氏常数值
酶
底物
固定化试剂
肌酸激酶 乳酸脱氢酶 α－糜蛋白酶 无花果蛋白酶 胰蛋白酶
ATP NADH N-乙酰酪氨酸乙酯 N-苯酰精氨酸乙酯 苯酰精氨酰胺
无（溶液酶） 对氨苯基纤维素
当 Da <<1时，酶催化的最大反应速度要大大 慢于底物的传质速率，此时该反应过程由反应动 力学控制；当 Da>>1时，底物的传质速率大大慢 于酶催化的最大反应速度，此时该反应过程由传 质扩散控制。
外扩散限制效应
（2）作图法求[S]i值和Vi值
根据 Vm[S]i
Km [S]i
kLa ([S]0
[S ]0
[S]0 [S]0
外扩散限制效应
引入 [S] [S]i ， K K m ，并定义 Da Vm ，
[S ]0
[S ]0
k L a [S ]0
[S ]i
Vm [S]0 1 [S]i
kLa [S]0 K m [S]i
[S ]0
[S]0 [S]0
Da [S] 1 [S] K [S]
Viห้องสมุดไป่ตู้
Vm [S ]0 Km [S]0
V0
在这种情况下，酶反应速度不受传质速率的 影响，为该酶的本征反应速度，或称在此条件下 可能达到的最大反应速度，用V0表示。
外扩散限制效应
当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应 速度很快，此时传质速率成为限制步骤。固定化 酶外表面上的底物浓度趋于零，有
Vi k L a[S ]0 Vd max
kLa ([S]0
[S]i )
《酶工程》 课后习题答案
① 酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或者服务于其它目的地一门应用技术。
② 比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或者 RNA 所拥有的酶活力单位数。
③ 酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④ 酶活国际单位 : 1961 年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件 )下，每分钟内能转化1 μmol 底物或者催化1 μmol 产物形成所需要的酶量为 1 个酶活力单位，即为国际单位(IU)。
⑤ 酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
酶的研究简史如下：(1)不清晰的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生： 1777 年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验； 1822 年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化； 19 世纪 30 年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684 年，比利时医生Helment 提出 ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素(酵素)；1833 年，法国化学家 Payen 和Person 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶； 1878 年，德国科学家 K hne 提出 enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”(希腊文)。
(3)酶学的迅速发展(理论研究)： 1926 年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930 年，美国的生物化学家 Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
I.酶工程发展如下：①1894 年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908 年，德国的Rohm 用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911 年， Wallerstein 从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949 年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出的控制子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971 年各国科学家开始使用“酶工程”这一位词。
酶的固定化
64
1）酶传感器的原理
酶传感器主要由固定 化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性 地“识别”并催化被 检测物质发生化学反 应 变换器：把催化反应 中底物或产物的变量 转换成电信号，通过 仪表显示出来。
65
（2）酶电极（葡萄糖氧化酶电极） 半透膜 酶胶层
感应电极
1967年Updike等采用 酶的固定化技术，将葡萄 糖氧化酶固定在疏水膜上， 然后再和氧电极结合，组 装成了世界上第一个生物 传感器——葡萄糖氧化酶 电极。
酶分子中可以形成共价键的基团：
氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基
载体 活泼基团
载体活化的方法
1. 活化
酶辅助蛋白交联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
32
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
3
4
5 6
7
游离酶：
固定化酶：
四、固定化酶的应用
Go 1.在工、农业生产上的应用 Go 2.在医药、治疗上的应用 Go 3.在分析化学中的应用
54
1、固定化酶在工农业生产上的应用
产物
酶或细胞
L-氨基酸 果糖浆
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶菌体
6-APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶
原料
乙酰-DL-氨基酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
55
产物
类固醇 L-丙氨酸
D-苯甘氨酸 ATP 核苷酸类味 精 乙醇
啤酒
1）酶传感器的原理
酶传感器主要由固定 化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性 地“识别”并催化被 检测物质发生化学反 应 变换器：把催化反应 中底物或产物的变量 转换成电信号，通过 仪表显示出来。
65
（2）酶电极（葡萄糖氧化酶电极） 半透膜 酶胶层
感应电极
1967年Updike等采用 酶的固定化技术，将葡萄 糖氧化酶固定在疏水膜上， 然后再和氧电极结合，组 装成了世界上第一个生物 传感器——葡萄糖氧化酶 电极。
酶分子中可以形成共价键的基团：
氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基
载体 活泼基团
载体活化的方法
1. 活化
酶辅助蛋白交联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
32
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
3
4
5 6
7
游离酶：
固定化酶：
四、固定化酶的应用
Go 1.在工、农业生产上的应用 Go 2.在医药、治疗上的应用 Go 3.在分析化学中的应用
54
1、固定化酶在工农业生产上的应用
产物
酶或细胞
L-氨基酸 果糖浆
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶菌体
6-APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶
原料
乙酰-DL-氨基酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
55
产物
类固醇 L-丙氨酸
D-苯甘氨酸 ATP 核苷酸类味 精 乙醇
啤酒
第三章固定化酶催化反应过程动力学
CS = CS 0 + rmax 2 6 DiCS 0 。 (r − R 2 )，其中存在有最大颗粒半径Rmax＝ 6D rmax
当酶反应动力学方程符合 M－M 方程时，无解析解，仅有数值解。 12、对于膜片状固定化酶，其解法与球形固定化酶相同，结果有所不同。 当酶反应动力学方程为一级反应动力学时，可解得： l cosh(φ ) L ，其中φ＝L rmax 。 CS = CS 0 cosh(φ ) Km iD 当酶反应动力学方程为零级反应动力学时，可解得：
此时，对此微分方程需要根据不同酶动力学特征进行求解。 当酶反应动力学方程为一级反应动力学时， rS =
r ) R ，其中φ＝ R 3 r sinh(3φ )
rmax CS ，可解得： Km
CS = CS 0
R sinh(3φ
rmax 。 Km iD
当酶反应动力学方程为零级反应动力学时， rS = rmax ，可解得：
RSi 的引入，避免了本征动力学参数求取的不便， k L aCS 0
8、表观丹克莱尔准数 Da＝
通过作图可获取外扩散有效因子。 9、化学抑制与扩散的负协同效应是指随着外扩散限制程度的增大，化学抑制的 程度相对减小，外扩散的限制作用在一定程度上掩盖了化学抑制的影响。 10、固定化酶的内扩散阻力主要来自于微孔内的阻力，其大小与固定化酶内部的
R
max =
6CS 0 D 6 × 0.5 × 10−3 × 2.1×10−9 mol ⋅ m 2 / L ⋅ S = = 2.09 ×10−3 m = 2.09mm rmax 0.12 × 0.012 ×10−3 mol / L ⋅ S
max
由于 R
= 2.09mm > R = 2mm ，因此催化剂活性体积所占的分率为 1。 k0 ( R 2 − r 2 )表示 。 6D
当酶反应动力学方程符合 M－M 方程时，无解析解，仅有数值解。 12、对于膜片状固定化酶，其解法与球形固定化酶相同，结果有所不同。 当酶反应动力学方程为一级反应动力学时，可解得： l cosh(φ ) L ，其中φ＝L rmax 。 CS = CS 0 cosh(φ ) Km iD 当酶反应动力学方程为零级反应动力学时，可解得：
此时，对此微分方程需要根据不同酶动力学特征进行求解。 当酶反应动力学方程为一级反应动力学时， rS =
r ) R ，其中φ＝ R 3 r sinh(3φ )
rmax CS ，可解得： Km
CS = CS 0
R sinh(3φ
rmax 。 Km iD
当酶反应动力学方程为零级反应动力学时， rS = rmax ，可解得：
RSi 的引入，避免了本征动力学参数求取的不便， k L aCS 0
8、表观丹克莱尔准数 Da＝
通过作图可获取外扩散有效因子。 9、化学抑制与扩散的负协同效应是指随着外扩散限制程度的增大，化学抑制的 程度相对减小，外扩散的限制作用在一定程度上掩盖了化学抑制的影响。 10、固定化酶的内扩散阻力主要来自于微孔内的阻力，其大小与固定化酶内部的
R
max =
6CS 0 D 6 × 0.5 × 10−3 × 2.1×10−9 mol ⋅ m 2 / L ⋅ S = = 2.09 ×10−3 m = 2.09mm rmax 0.12 × 0.012 ×10−3 mol / L ⋅ S
max
由于 R
= 2.09mm > R = 2mm ，因此催化剂活性体积所占的分率为 1。 k0 ( R 2 − r 2 )表示 。 6D
固定化酶
⑧充分考虑到固定化酶制备过程 和应用过程中的安全因素。
固定化载体的选择标准
① 载体的形式 ② 载体的结构 ③ 载体的性质
④ 酶偶联量或装载量和实效系数
二、固定化酶的制备方法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法 网格法
非化学结合法
包埋法
微囊法 交 联 法
化学结合法
共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
第一节
第二节
酶的固定化
辅酶的固定方法
第三节
第四节
固定化细胞
固定化酶的性质及其影响因素 Nhomakorabea
第五节
固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
解决办法??
第一节
酶的固定化
一、固定化酶（Immobilized Enzyme）
定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的 酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收 重复使用。
固定化酶的优缺点
固定化酶优点：
(1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应
固定化酶缺点：
①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物， 对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需 要辅助因子的催化反应 不适宜于多酶反应
法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基 丙烯酸甲酯等。
界面聚合法
化学方法。将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合， 形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊中。所得的微 囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中 发生化学反应而失活。
食品酶学(酶固定化技术)
5 包埋法固定化技术
微胶囊包埋法： • 包埋法
包埋法的特点是:
微胶囊包埋法按制作特征不同，分界面聚合法、界面沉淀格内 乳化法。 A 不影响酶蛋白分子的结构和空间构型 , 固定
或包埋在高分子半通透膜中, 将酶蛋白控制在一个半封 ① 界面沉淀法： 利用某些高分子聚合物在水相和有机相的界面上溶 化的酶活收率高。 闭的空间，这种固定化方法即为包埋法。
一、 酶固定化方法 / 技术
•
• • • • • 按固定化反应类型分, 酶固定化方法分以下四种 吸附法 共价法 交联法 包脉法 近年来人们将吸附法和交联法结合起来，建立了 吸附－交联法
一、 酶固定化方法 / 技术
1 吸附法固定化技术 常用的固定化载体 : • 此法是酶固定化研究最早的方法 , 以吸附剂作 载体, 利用物理吸附的原理,对酶蛋白进行固定 高岭土、磷酸钙凝胶、多孔玻璃、羟基磷灰石; 化的一种方法。 DEAE-SephadexA50, SephadexA25, DEAE-纤维 • 此法的优点是: 素等。 • 固定化酶的制备简单; • 酶固定化载体的再生方便; • 缺点: • 酶与载体的结合不牢固 , 在固定化酶的应 用过程中, 受到介质的 pH、离子强度、反应温 度等因素的影响。
二、 固定化酶的性质
• 由于固定化酶由可溶性状态，变为不溶性状态，酶蛋 白的一系列酶学特性都要受到不同程度的影响。
• ① 酶的活力
• ② 最适温度 • ③ 最适pH • ④ 稳定性 • ⑤ Km
一、 酶固定化方法/技术
3 吸附－交联法固定化技术 • 吸附－交联法是将吸附法和交联法结合起来， 建立的一种良好方法，两种方法的结合，在一 定程度上克服了2种方法的不足。 ① 吸附法酶与载体结合不牢固； ② 交联法酶与载体交联效率低； ③ 交联法载体局限性；
微胶囊包埋法： • 包埋法
包埋法的特点是:
微胶囊包埋法按制作特征不同，分界面聚合法、界面沉淀格内 乳化法。 A 不影响酶蛋白分子的结构和空间构型 , 固定
或包埋在高分子半通透膜中, 将酶蛋白控制在一个半封 ① 界面沉淀法： 利用某些高分子聚合物在水相和有机相的界面上溶 化的酶活收率高。 闭的空间，这种固定化方法即为包埋法。
一、 酶固定化方法 / 技术
•
• • • • • 按固定化反应类型分, 酶固定化方法分以下四种 吸附法 共价法 交联法 包脉法 近年来人们将吸附法和交联法结合起来，建立了 吸附－交联法
一、 酶固定化方法 / 技术
1 吸附法固定化技术 常用的固定化载体 : • 此法是酶固定化研究最早的方法 , 以吸附剂作 载体, 利用物理吸附的原理,对酶蛋白进行固定 高岭土、磷酸钙凝胶、多孔玻璃、羟基磷灰石; 化的一种方法。 DEAE-SephadexA50, SephadexA25, DEAE-纤维 • 此法的优点是: 素等。 • 固定化酶的制备简单; • 酶固定化载体的再生方便; • 缺点: • 酶与载体的结合不牢固 , 在固定化酶的应 用过程中, 受到介质的 pH、离子强度、反应温 度等因素的影响。
二、 固定化酶的性质
• 由于固定化酶由可溶性状态，变为不溶性状态，酶蛋 白的一系列酶学特性都要受到不同程度的影响。
• ① 酶的活力
• ② 最适温度 • ③ 最适pH • ④ 稳定性 • ⑤ Km
一、 酶固定化方法/技术
3 吸附－交联法固定化技术 • 吸附－交联法是将吸附法和交联法结合起来， 建立的一种良好方法，两种方法的结合，在一 定程度上克服了2种方法的不足。 ① 吸附法酶与载体结合不牢固； ② 交联法酶与载体交联效率低； ③ 交联法载体局限性；
《固定化酶》PPT课件 (2)
包埋法
网格法 微囊法
化学结合法
交联法 共价结合法
1、物理吸附法
(physical adsorption)
• 是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
• 选择载体的原则
①要有巨大的比表面积
② 要有活泼的表面 ③ 便于装柱进行连续反应。
常用的载体有：
• (1)有机载体： • 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。
第三章
酶的固定化
• 第一节 酶的固定化 • 第二节 辅酶的固定方法 • 第三节 固定化细胞 • 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 • 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
• 绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
• 特点:
它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到 高聚物上。
缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚。调 整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
• 海藻酸钠
它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al 3+凝胶化 ，操作简单经济。
• K-角叉莱胶（卡拉胶）
• 卡拉胶(K-Carrageenin)是由角叉菜(又称鹿角菜；Cawageen)中提取的一种多糖。
可以冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。 包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化 的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好 。
(2)微囊化包埋法
➢微囊法主要将酶封装在半透性聚合物膜的微 囊中（如胶囊、脂质体和中空纤维）。
➢胶囊和脂质体主要用于医学治疗； 中空纤维主要适于工业使用 。
➢主要包括
（1）界面沉淀法 （2）界面聚合法 （3）脂质体包埋法
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叠氮化物
固定化酶 －CH2CO-NH 酶
羧甲基纤维素叠氮法制备固定化葡萄糖淀粉酶程序
d.烷化法
• 一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联 酶,与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化 酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。
优缺点
优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长
时间使用。
缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏
（2）所用载体
重氮化法：具有氨基的不溶性载体（R－NH2）。 以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。 多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃 烷 化 法：卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤 维素、碘乙酰纤维素） 含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）
（3）方法
载体的活化：通过一定的方法，在载体上引进一个活泼基团
包埋法制备固定化菌体应用举例
包埋材料 琼脂
菌种 大肠杆菌 大肠杆菌
酶系
用途
明胶－戊二醛 短乳杆菌 链霉菌 聚丙烯酰胺 大肠杆菌
醋酸纤维素 大肠杆菌
谷氨酸脱羧酶 制造γ-酪蛋白 青霉素酰胺酶 生产6-氨基青霉烷酸 (6-APA) 葡萄糖异构酶 从葡萄糖生产高果糖 浆
天门冬氨酸酶 青霉素酰胺酶 生产6－APA （裂解） 青霉素酰胺酶 生产半合成青霉素 （合成）
c.叠氮法
• 在酶分子与载体间形成肽键的固定化方法。主要 是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸 盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反 应，从而形成肽键。
纤维素
CMC －CH2COOH
+盐酸甲醇
CMC－甲酯 ＋肼 制备酰肼 CMC－酰肼 亚硫酸钠 ＋ 盐酸 CMC－叠氮化物 ＋NH2 酶
第四节 固定化酶催化反应动力学
• 固定化对酶活性及酶反应系统的影响 • 酶固定化后的性质变化
• 固定化酶反应动力学
评价固定化酶的指标
• 相对活力＝固定化酶活力/相同蛋白量的游离酶活力＊ 100% • 酶结合效率＝（加入的总酶活力－未结合的酶活力）/加 入的总酶活力＊100% • 酶活力回收率＝固定化酶总活力/加入的总酶活力＊ 100% • 当固定化方法对酶活力没有明显影响时，酶结合效率与酶 活力回收率近似。
(1)保持菌体的完整，防止菌体自溶。 (2)防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时需抑制胞内其 他酶的活性防止副产物的形成。 (3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。
2. 缺点：
一 包埋法
1 原理
将细胞包进多孔载体内，小分子的底物和产物均可 自由出入，而细胞却不会漏出。。
2 方法
常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、琼脂
特点
• 反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较 低。尽可能地降低交联剂的浓度和缩短反应时间 有利于固定化酶比活性的提高。 • 缺点： 固定化后，往往颗粒小，机械性能差。
克服的方法
• 酶先吸附在载体上，或者包埋在胶内，微囊内， 再交联或者固定成酶膜，或者酶网颗粒
3 包埋法制备固定化酶
酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在 凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。
构象改变、立体屏蔽
2.分配效应
• 分配效应是固定化载体亲水、疏水性质对底物、产物在微 环境和宏观体系之间发生的不等分配，从而改变酶反应系 统组成的平衡而最终影响酶反应速度的一种效应。
⑴ 载体与底物带相同电荷，Km’>Km 固定化酶降 低了酶的亲和力。 ⑵ 载体与底物电荷相反，静电作用，Km’<Km • 上面的效应可以通过调节离子强度减弱而消除
强
交联法
包埋法
难 中 易变 强
难 高
底物特异性
结合能力
不变
中
不变
弱
再生
可能
可能
不可
不可
不可
第二节 辅酶的固定化
1. • • • • 辅基的固定化 对于必需辅基的酶，固定化酶时一般将辅基同时固定。 一般辅基分子和载体之间要接入0.5～1.0nm长的间隔基。 将辅基共价结合于载体上之前，要考虑在辅基分子的适 当位置引入功能团，如引入羧基或氨基，使之易与载体 偶联。 磷酸吡哆醛，FAD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟 啉等可利用分子本身所具有的功能团。 将具有功能团的辅基先与间隔基结合，再与活化的载体 偶联；或先使间隔基与活化载体结合，再与辅基偶联。
引聚剂：
过硫酸铵、核黄素
（3）制备的固定化酶
凝胶或膜 聚丙烯酰胺凝胶
淀粉 琼脂
酶 α、β－淀粉酶 葡萄糖氧化酶 乳酸脱氢酶 胆碱酯酶 青霉素酰胺酶
2 微型胶囊法 （1）原理 把酶包在超薄半透性 的聚合物膜中，制成 球状含酶微型胶囊。
（2）特点
微囊直径几微米～几百微米。 低分子底物可以自由通过并进入微囊内。 与酶反应后的生成物被排除在微囊外， 酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中， 外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内
a. 重氮法
a.将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处 理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件 下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
b.溴化氰法
• 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下， 与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可 与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。 • 此方法固定化后相对酶活力比较高，且相当稳定，同时操作 也简便。是最受欢迎的一种方法.
2 共价交联法
双功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使
酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶.
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
发生作用的氨基酸残基
：
酪氨酸的酚基 胱氨酸的SH巯基 N－末端的a－氨基。
常用的双功能或多功能试剂：
戊二醛 聚甲叉双碘乙酰胺 双重氮联苯胺
(3)采用疏水载体时，底物是极性物质，Km固定化 后会升高。采用疏水载体时，底物是疏水物质， Km固定化后会降低。
3扩散效应
• 外扩散：底物从液相主体向固定化酶的外表面扩 散，或产物从固定化酶外表面向液相主体的扩散， 外扩散发生在催化反应之前或之后。
•
2、辅酶的固定化
• 辅酶与酶蛋白的结合是松弛的，在固定时要保证能与两种 酶都能有最恰当的结合。 • 将辅酶固定于一高分子上，然后用微囊法将辅酶和两种酶 一同包埋于微囊内。 • 高分子化一般的顺序是先在辅酶的一定部位引入适当的功 能基团或间隔基，生成辅酶的衍生物，然后再与水溶性高 分子共价结合。
第三节 细胞固定化
例子
• 氨基酰化酶20mL固定化，反应后滤液及洗涤液 共50mL。若原酶活力1000u/mL，洗涤液活力 20u/mL。0.5g固定化酶活力为100u（共得50g 固定化酶）。问固定化酶的相对活力是多少？回 收率及结合率是多少？
一、 固定化对酶活性及酶反应的影响
1.构象改变、立体屏蔽
• 构象改变:固定化过程中酶和载体的相互作用引起了酶的 活性中心或调节中心的构象发生了改变，从而导致酶活性 下降的一种效应。多出现于吸附法和共价结合法。 • 立体屏障：载体的孔隙太小，或固定化的方式与位置不当， 给酶的活性中心或调节中心造成了空间障碍，因而底物与 效应物无法和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。出现 于包埋、吸附和共价结合法。
共价结合
• 通过共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基 酸功能基团连接在不溶于水的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羧基：肽链C－末端的α –羧基，天冬氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
一、什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
化学偶联
固定化酶的源流
固定化酶是1971年在美国举行的第一次世界酶会议 上推荐确定的。又称水不溶性酶、固相酶。 50年代开始。将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，再与羧 肽酸、淀粉酶等结合制成最早的固定 化酶 1969年。 用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基。 第一个工业生产的固定化酶。
包埋方法有两种： •格子型固定化酶
•微型胶囊法
•格子型固定化酶
（1）原理
以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存 在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的 网状格子中。反应为厌氧反应。
（2）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）
丙烯酰 胺
固定化 酶
光照 切 割 聚合反应 凝胶酶块
酶液
N，N－ 双丙烯 酰胺
二 载体结合法（吸附、离子结合法）
1 原理
将细胞在适当的条件下与载体吸附或形成络合物 固定在载体上。
2 常用载体
硅藻土、多孔玻璃、离子交换纤维素、离子树脂 、DEAE－纤维素。
3 优缺点
优点：方法简单、载
载体 菌体 酶 用途 离子交换纤维 丝状菌孢子 转化酶 蔗糖的转化 素 阴离子树脂 放线菌 葡萄糖异构 制造果糖 酶 DEAE-纤维素 巨大芽孢杆 青霉素酰胺 制造6APA 菌 酶
固定化酶的特点：
• 优点： 1. 不溶于水，易于与产物分离； 2. 可反复使用； 3. 可连续化生产； 4. 稳定性好。 • 缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活， 增加酶的成本
固定化酶的作用模型
以羧甲基纤维素固定 葡萄糖淀粉酶水解淀 粉生产葡萄糖为例说 明。
（1）作用模型
可以连续进行催化 反应（适宜的底物 浓度、温度、pH值 ）
纤维素 麸素 硅胶
离子结合
• 通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固 定化方法。 • 吸附剂 离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树 脂等。