PCR引物设计汇总
PCR引物设计要点
PCR引物设计要点PCR引物设计要点1. 书写规则设计引物时，5’端引物与目的序列正义链相同，而3’端引物则与目的序列正义链互补，书写时从引物的5’端至3’端（即5’端引物不变，3’端引物与目的序列互补并相反）；2. 引物长度一般引物长度为18~30碱基（不包括5’端添加的修饰），引物太长和太短都不好；3. GC含量一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，尤其3’端不应超过3个连续的G或C。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，上下游引物的GC含量不能相差太大；4. 退火温度可以用软件PrimePrimer来计算退火温度，在引物短于20bp时，可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度)，有效引物的Tm为55~65℃之间较好，如果待扩增基因的GC含量较高（超过50%），引物的退火温度可设计得高一点，例如接近65℃，因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。
一对引物的退火温度应尽量接近，相差范围应在5℃之内；一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃，如果扩不出，可试着将退火温度降低5℃和升高5℃再试一下，但一般不要1℃1℃升，或1℃1℃降，因为这样效果不大；5. 避免与靶DNA的错配引物要具有特异性，与非特异扩增序列的同源性不应超过70%或有连续8个互补碱基同源，可针对基因组BLAST检测，看是否能错配到其它非特异顺序上；6. 避免引物及模版的二级结构区域引物自身避免有连续4个碱基的互补，若不能避开这一区域时，可尝试7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP。
若有可能，也应尽量避免扩增含稳定二级结构的目的片段(可用软件估计，一般待扩区域自由能△G小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功)；7. 避免引物二聚体引物之间避免有连续4个碱基的互补以免形成二聚体，尤应避免3’端的互补重叠；8. 引物3’端1) 3’端不应超过3个连续的G或C，以免使引物在G+C富集序列区错误引发；2) 除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3’端不能发生错配；3) 如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率；4) 避免在引物的3’端使用碱基A，以免增加使用Taq酶时的错配效率；5）如果片断连入表达载体或转基因载体，基因后面带有其它tag，如His tag,或Fast tag, GFP, GUS 等，注意设计引物时一定要去掉基因的stop codon，否则tag 就没有了；但如果这些tag是在基因之前，则注意去掉基因的start codon，因为此时基因跟在tag之后，用的是载体上tag的start codon。
PCR引物(普通)设计原则(归纳)
•
• 引物的序列：
•
夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物
与模板的复性结合。引物自身不能有4个碱基的互补。 • 2.两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′
1.引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发
端的互补 重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
3.不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在 。降低引物与模板相似性的一种方法是， 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超 过3个连续的G 或C，因这样会使引物在GC富集序omposition）过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature） 是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有 效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 2.引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性， △G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低 （绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并 引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析） 。引物二聚体 及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。
端开始的，不能进行任何修饰。
•
(A).3′ 端也不能有形成任何二级结构。 (B).尤其3′端不应超过3个连续的G 或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 引物3′端不能选择A，最好选择T.引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差 异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好 选择T. (C).如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简 并，会影响扩增的特异性与效率。
PCR引物设计原则总结
PCR引物设计原则总结PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
（完整版）PCR技术（包含引物设计）
（完整版）PCR技术（包含引物设计）聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板- 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
PCR引物设计方法综述
PCR引物设计方法综述PCR引物设计方法综述PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因工程、生物医学研究、疾病诊断和基因表达分析等领域得到广泛应用。
PCR引物设计是PCR实验成功与否的重要因素之一，它对PCR反应的特异性和效果有着关键影响。
本文将综述PCR引物设计的一些常见方法。
1. 引物的长度和碱基组成合适的引物长度一般在18-30个碱基对之间，过短可能导致非特异性扩增，过长则可能降低扩增效率。
此外，引物中碱基的组成也要考虑。
GC含量通常应在40-60%之间，因为GC碱基对的热稳定性较高，有助于提高PCR反应的效果。
2. 引物的Tm值Tm值（熔解温度）是引物设计中重要的参数，表示DNA链的熔解温度。
引物对应的Tm值应该相似，一般在50-65℃之间。
Tm值的计算可以使用公式Tm= 2(A + T) + 4(G + C)，其中A、T、G和C分别表示引物中的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶的个数。
3. 引物的特异性引物的特异性是PCR引物设计的关键。
在设计引物时，必须确保引物与目标序列的互补区域没有重复序列或能够和其他非目标DNA序列结合。
可以使用计算机软件进行引物特异性检查，如BLAST等。
此外，设计引物时应考虑引物的位置，尽可能避免设计在重复序列上。
4. 引物的杂交温度引物的杂交温度是PCR反应的另一个重要因素，影响PCR引物与模板DNA的结合和扩增效率。
一般情况下，引物的杂交温度应在Tm值的2-5℃之间。
较高的杂交温度有助于提高特异性，但也可能降低引物与模板DNA的结合能力。
5. 引物的设计工具和软件现代生物信息学提供了许多实用的工具和软件用于PCR引物设计。
比如，Primer3软件是一种常用的引物设计工具，能够自动设计引物，计算引物的Tm值和特异性等参数。
其他常用的软件还包括OligoAnalyzer、Beacon Designer和GeneFisher 等。
6. 引物的修饰在一些特殊的PCR反应中，引物的修饰可以提高PCR扩增效率和特异性。
引物设计知识点归纳图表
引物设计知识点归纳图表引物设计是一项重要的实验技术，在分子生物学、基因工程和遗传学等领域中具有广泛的应用。
合理设计和选择引物能够保证实验结果的准确性和可靠性。
本文将对引物设计的各个知识点进行归纳总结，以图表的形式展示，方便读者理解和应用。
1. 引物的长度长度是影响引物特异性和扩增效率的重要因素，合理选择引物长度能够提高PCR扩增的特异性和效率。
根据目标序列的特点，引物长度的选择范围一般为18-30个碱基对。
2. 引物的GC含量引物的GC含量对扩增的特异性和效率有重要影响，GC含量过高或过低都会影响PCR反应的结果。
通常可以选择引物的GC含量在40% - 60%之间，以提高PCR反应的成功率。
3. 引物的熔解温度（Tm值）引物的熔解温度是指引物在PCR反应中解链的温度，它与引物的碱基对组成、长度和浓度等因素相关。
合理选择引物的Tm值能够提高PCR的效率和特异性。
一般来说，两个引物的Tm值应该接近，以保证二者同时发挥作用。
4. 引物的互补性引物之间的互补性会导致二聚体的形成，影响扩增效果。
因此，设计引物时需要避免引物之间的互补性，以免产生非特异性扩增产物。
5. 引物的特异性引物的特异性是指引物只与目标序列互补而不与其他非目标序列互补。
特异性的引物设计可以通过使用比对软件进行序列比对来保证。
6. 引物的交叉反应引物的交叉反应指的是引物与非目标序列发生非特异性扩增。
为了避免引物的交叉反应，可以通过检查引物的互补性和特异性来进行预防。
7. 引物的杂交效率引物的杂交效率会影响PCR扩增的结果，因此合理设计引物的杂交效率可以提高PCR反应的特异性和效率。
杂交效率可以通过计算引物的形成结构和碱基对数目来预测。
总结：引物设计是PCR技术中至关重要的一步，合理的引物设计能够保证PCR扩增的有效性和特异性。
在设计引物时需要考虑引物长度、GC 含量、熔解温度、互补性、特异性、交叉反应和杂交效率等因素。
通过合理选择和设计引物，可以最大程度地提高PCR扩增的准确性和可靠性。
引物设计知识点总结图
引物设计知识点总结图引物设计是在分子生物学研究中常用的实验技术之一，用于扩增目标DNA序列。
本文将就引物设计的相关知识点进行总结和图示，以帮助读者更好地理解和应用该技术。
一、引物设计的基本原理在引物设计之前，我们需要了解PCR（聚合酶链式反应）的基本原理。
PCR是一种快速扩增DNA的方法，其关键在于引物的选择和设计。
引物是PCR反应中的两段寡核苷酸序列，分别与目标DNA序列的起始点和终止点互补配对。
通过PCR反应，引物与目标DNA序列结合，聚合酶随后从引物的3'端开始合成新链，形成所需扩增的DNA。
二、引物设计的关键要点1. 引物长度：引物长度通常为18-30个碱基，过短的引物可能无法特异性地结合目标DNA，而过长的引物则可能导致不必要的非特异扩增产物。
2. 引物序列：引物的序列应与目标DNA的互补序列相匹配，确保引物能够特异性地结合目标DNA并进行扩增。
3. 引物峰值温度(Tm值)：Tm值是引物设计中非常重要的参数，它表示引物与目标DNA的解链温度。
引物的Tm值应相似，以确保二者能够在相同的温度下扩增。
4. 引物GC含量：引物的GC含量直接影响其Tm值，较高的GC 含量通常意味着较高的Tm值。
适当调整GC含量可以帮助优化引物的扩增效率。
5. 引物间的相互作用：在引物设计过程中，需要避免引物之间的互补性，以免引物间发生二次结合导致非特异性扩增。
三、引物设计的步骤示意图[图示]四、引物设计的实际应用引物设计广泛应用于分子生物学领域中的DNA克隆、基因表达分析、突变检测等实验中。
具体应用包括：1. DNA克隆：通过引物设计扩增目标DNA序列，可用于获得目标基因的全长序列或特定片段。
2. 基因表达分析：通过引物设计扩增特定基因的编码区域，可用于研究该基因的表达水平和调控机制。
3. 突变检测：通过引物设计扩增包含突变位点的DNA片段，可用于检测目标基因的突变类型和频率。
五、引物设计的常见问题及解决方法1. 引物的Tm值差异较大：可通过调整引物的长度和GC含量来优化Tm值，使其相似。
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ＰＣＲ原理
1、引物是否必须是从基因片段起始端开始？
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的
核酸片段，使其能有效地扩增目的DNA序列
十条PCR引物的设计原则总述
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。（如何避免） ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？） ④ G+C含量在40%~60%之间。 ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体） ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5’端可以修饰。 ⑨ 引物3’端不可修饰。 ⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。 其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条 件下，50%寡核苷酸双链解链的温度， 有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复 性条件最佳。 Tm温度过高过低会出现问题
6个碱基的酶切位点，15个碱基序列配对， 一共25个左右。 先调整 premer5 的flie 的 preferences 的 默认碱基长度
4、要设计两条链的引物，Sense链和Anti-
Sense链，注意上下游引物： Sense链是上游 引物， Anti- S物设计实例
PREMIER5设计引物
题目：设计PCR引物将Tspo基因扩增后，能
用双酶切连接到pET28a（+）载体上，并要 求Tspo基因能完整的表达
Tspo基因序列
atgac tcaatcaaat aataccggaa tactggaaaa gtttgtcaat acagtaatgg gggtaaaaac agaaaatcaa caacagcctt caaatacatt aatcgctact acgcaagcac tggatatcag agcagtttta gtttacaaac tagggactat cttacaaata gcagctatga tgctggcttt actgggaatg gaaaaattag taatgctgat tgataaaaat tctcacctgc ccagttggtt tagcacttta ttagctgtat tatttttcgc tttattaagt attcgttcgc gaattttttc actcttagat aacacccgtt ctcgtaagac ctatgaccag gtaatcagac caagatgggc acctccacct ttagtatttc ctatagtttg gatgattatt gcagttttgc gggtaatttc ttccgtatta atttggcagc aaatgcatca ccaattttta gcactgcctt taattttatt tgtggtgcat ttggctttag gagatacttg gaatacgatt tttactgtag aacggagatt aggtgcggct gttcctgtgg ttattttagg cccttggtta tctgctctag tagtgacggc aatttattgg caaactaatc ctgtagcggg aatgattttt tcgttttctt gtatctggct aactgtggct gctgtattag tatttagaat ttggcaatta aatggttcag agccattgta tcctttaaaa ctcacaccag tggaaaaata a
5、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物
长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基 Why？？？？？
6.选择S链来编辑引物，将酶切位点碱基设计
上去，同时根据需要设置保护碱基，同时注意 平衡GC含量
7.查看Hairpin、Dimer、FalsePriming、
CrossDimer、GC含量等处，调整和编辑引物
1、先查找序列有哪些酶切位点，确定使用哪
几个酶切位点，酶切位点和阅读框架方向？？
确定：
上游引物BamHI， GGATCC
下游引物 Hind IⅡ， AAGCTT
2、注意克隆的基因阅读框架和载体的阅读框
架保持一致，如果是用pET28b（+），该怎 样调整引物。
3、确定引物碱基的个数，3-4个保护碱基，
8.选择A链来编辑引物，则先将浮框拉至最右
边，再进行编辑引物
9.查看Hairpin、Dimer、FalsePriming、
CrossDimer、GC含量等处，反复调整和编 辑引物，直至获得满意的结果
以上是模板较单一的基因引物设计方法
如果是从基因组上克隆单个基因，则最好能
知道基因上下游序列，如克隆Fremyella diplosiphon CpeB 上的基因，可以使用引 物搜索功能，提高引物设计的准确性
某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好 避开二级结构区域。用有关计算机软件可以 预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选 择模板。实验表明，待扩区域自由能 （△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不 能成功。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为 20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C） +（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时， 最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适 温度（74℃),不能保证产物的特异性。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的 互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物 间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3’端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何 修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能， 引物3′端不能发生错配。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩 增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不 影响扩增的特异性。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物 素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结 合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突 变序列和引入一启动子序列等。 一般引物要引入酶切位点 一般还需要引入保护碱基
人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。
10.密码子的简并 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的 第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增 特异性与效率。 引物设计还要结合克隆载体的酶切位点 阅读框架 (尤其是要表达时，参考表达载体)
引物上是不是一定要设计加上酶切位点，如果没有 酶切位点，如何连接到载体上去？
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要 有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超 过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C 富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身 会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种 二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的 复性结合。若用人工判断，引物自身连续互 补碱基不能大于3bp。
1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或 有连续8个互补碱基同源。
有时由于模板的复杂性而无法判断，但尽量避免和 基因内部有过高的同源性 哪些DNA片段可作为模板？GFP在质粒上，和GFP 在基因组上？哪个作为模板，更容易得到专一的 GFP片段？
2.避开产物的二级结构区