食品中大肠菌群的测定(附MPN检索表)
食品中大肠菌群的测定
水质或食品的大肠菌群检测
实验小结 实验安排
❖ 水样采取 ❖ 初发酵试验（第10周完成） ❖ 平板分离 （第10周完成） ❖ 涂片，革兰氏染色，镜检 （第11周完成） ❖ 复发酵试验 （第11周完成）
②用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生 理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释 液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释 液
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个 稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。
2. 乳糖初发酵试验
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼 脂平板上，置（36±1）0C温箱内，培养18h~24h，然后取出， 观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。
4.乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管 试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌， 确能发酵乳糖产生气体。
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发 酵乳糖产生气体的细菌。
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上 者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖 发酵管。每一个稀释度接种3管，置（36±1）0C温箱内，培 养（24±2）h，如所有乳者，则按下列程续进行
在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1~2个进 行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）0C的温 箱内培养（24±2）h，观察产气情况。
凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即 报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为 阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。
5.报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告 每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。
大肠菌群最可能数(MPN)检索表1
编辑版word
一种微生物活菌数快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：ａ）样品的选择：检测样品分为固体样品和液体样品；ｂ）采样样品的制备：通过无菌操作取一定量溶液样品进行离心处理后，取上清液，再以更高的速度离心处理，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液；ｃ）微生物活菌数的检测：将移液器取出的底部溶液，涂在载玻片上，经干燥固定，用美兰染色，冲洗后用生物显微镜镜检，记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来计数微生物数量。
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食品中大肠菌群的测定附mpn检索表
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述(一)大肠菌群的定义及范围根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。
表5-4 大肠菌群生化特性分类表产气克雷伯氏菌+ + +n阴沟肠杆菌+ —+ + ——+/——注：+,表示阳性；一，表示阴性；+/-,表示多数阳性，少数阴性。
由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌i型和ni型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。
(二)大肠菌群的测定意义1、粪便污染的指标细菌早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。
一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold. Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。
据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个/g —109个/g。
若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。
根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。
所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。
当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。
2.粪便污染指标菌的选择作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。
食品中大肠菌群的检测
食品中大肠菌群的测定
一、实验材料 1、设备和材料 温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、 平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针 2、培养基及试剂 乳糖 — 胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、革兰氏染色 液
大肠菌群MPN记数法
三、实验方法与步骤 1、采样及稀释 ①固体和半固体样品：称取检样 25g，放于盛有 225ml 磷酸盐 缓冲液或生理盐水的无菌均质杯，以8000r/min～1000r/min的 速度处理1-2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲溶液或生理盐 水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，做成1：10 的样品匀液。 ②液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓 冲溶液或生理盐水的无菌锥形瓶充分混匀，制成1:10的样品匀 液。 ③样品匀液的PH应在6.5-7.5，必要时分别用1mol/LNaOH溶液 或1mol/LHOI溶液调节。
④用 1ml无菌吸管或微量移液管吸取 1:10样品匀液 1ml沿管壁 缓缓注入9ml磷酸盐缓冲溶液或生理盐水的无菌试管中，振荡 试管，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 ⑤根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成 10倍 递增系列样品匀液。 2. 初发酵试验：每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品 匀液，每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白肉汤，每管接 种1ml，如未产气则继续培养至（48±2）h，产气者进行复发 酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳 糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏 阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群主要来源于人畜粪便，故以此作 为粪便污染指标来评价食品的卫生质菌的检测
大肠杆菌的生物学特性 大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌， 分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 大肠杆菌为人和动物肠道中的常 居菌，一般多不致病，在一定条件下可 引起肠道外感染。
10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。
2范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的计数。
3术语和定义3.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4责任质量部组织制订、化验室负责实施。
5内容5.1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
5.1.4 天平：感量0.1 g。
5.1.5 均质器。
5.1.6 振荡器。
5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。
5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
5.1.11 菌落计数器。
5.2培养基和试剂5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。
5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。
5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。
5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。
5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。
5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。
5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
5.3大肠菌群MPN 计数法5.3.1 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
食品微生物学检验 大肠菌群 MPN 计数法
9
无菌生理盐水
氯化钠8.5 g
蒸馏水1 000ml
称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000ml蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。
磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0 g
磷酸氢二钾(K2HPO4)2.75 g
磷酸二氢钾(KH2PO4)2.75 g
月桂基硫酸钠0.1 g
蒸馏水1 000ml
pH 6.8±0.2
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10ml。121℃高压灭菌15 min。
注：用月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，称取35.6 g于1 000ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15 min。双料LST肉汤除蒸馏水外，其他原料加倍。
蒸馏水500ml
pH 7.2
贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500ml蒸馏水中，用大约175ml的1 mol/L氢氧化钠溶液调节，用蒸馏水稀释至1 000ml后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25ml，用蒸馏水稀释至1 000ml，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。
10
1 mol/L NaOH
如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
3
复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种BGLB管中，36℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
4
大肠菌群最可能数（MPN）的报告
大肠菌群最可能数(MPN)检索表1
注1:本表采用3个稀释度【0.1g(m L)、0.01g(m L)和0.001g(m L)］，每个稀释度接种3管。
注2:表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)0.0001g(mL)时，则表内数字应相应提高10倍，其余类推。
一种微生物活菌数快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：a）样品的选择：检测样品分为固体样品和液体样品；b）采样样品的制备：通过无菌操作取一定量溶液样品进行离心处理后，取上清液，再以更高的速度离心处理，弃去上清液，用移液器取出底部少量溶液；c）微生物活菌数的检测：将移液器取出的底部溶液，涂在载玻片上，经干燥固定，用美兰染色，冲洗后用生物显微镜镜检，记录被美兰染色且呈现空心状态的图像的个数来
计数微生物数量。
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MPN法测定食品中大肠杆菌群数
知识点：MPN法测定大肠杆菌群数情境：微生物检测技术任务：MPN法测定大肠杆菌群数课程：食品微生物技术MPN 法测定大肠菌群原理一、大肠菌群什么叫大肠菌群大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48h内发酵乳糖并产酸产气。
二、MPNMPN❞食品中大肠菌群数是以每100 mL（g）检样内大肠菌群最近似数（The most probable number，简称MPN）表示。
❞据此含义，所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均应以每mL（g）食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。
三、MPN法测定原理MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
大肠菌群测定步骤1.液体样品稀释以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
2.梯度稀释❞用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取（1:10）样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，作成1:100的样品匀液。
❞根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1 mL灭菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
五、初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。
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2、学习并掌握大肠菌群的检验方法。
三、原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处：
①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。
⑧大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。
②在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。
3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义
粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。
由于大肠菌群作为粪便污染指标菌而被列入食品卫生微生物学常规检验项目，如果食品中大肠菌群超过规定的限量，则表示该食品有被粪便污染的可能，而粪便如果是来自肠道致病菌者或者腹泻患者，该食品即有可能污染肠道致病菌。所以，凡是大肠菌群数超过规定限量的食品，即可确定其卫生学上是不合格的，该食品食用是不安全的。
二、实验目的
②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计按种3管。也可直接用样品接种。
2．乳糖初发酵试验
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。
许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。在腹泻患者所排粪便中，非典型大肠杆菌常有增多趋势，这可能与机体肠道发生紊乱，大肠菌群在型别组成的比例上因而发生改变所致；随粪便排至外环境中的典型大肠杆菌，也可因条件的改变。使生化性状发生变异，因而转变为非典型大肠杆菌。由此看来，大肠菌群无论；庄粪便内还是在外环境中，都是作为一个整体而存在的，它的菌型组成往往是多种的，只是在比例上，因条件不同而有差异。因此，大肠菌群的检出，不仅反映校样被粪便污染总的情况，而且在一定程度上也反映了食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况，所以具有广泛的卫生学意义。
3、培养基及试剂
单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA)
4、其它设备和材料
温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。
四、实验步骤
1200
1300
3800
3
3
3
3
1
1
1
1
0
1
2
3
480
750
1200
1600
70
140
300
2100
2300
3800
3
3
3
3
2
2
2
2
0
1
2
3
930
1500
2100
2900
150
300
350
3800
4400
4700
3
3
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
2400
4600
11000
24000
360
710
1500
13000
实验六食品中大肠菌群的测定
一、概述
(一)大肠菌群的定义及范围
根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。
(一)检验程序
大肠菌群检验程序见图5—2
(二)操作步骤
1．采样及稀释
①以无菌操作将校样25g(或25mL)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以800r／mjn—1000r／min的速度处理1min，做成1：10的稀释液。
(二)大肠菌群的测定意义
1、粪便污染的指标细菌
早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。
将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置(36土1)℃培养箱内，培养(24土2)h，的所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，勿有产生者，则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。
3．分离培养
0.1mL(g)×3
0.01mL(g)×3
下限
上限
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
30
30
60
90
<5
90
0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
2
3
30
60
90
120
<5
130
0
0
0
0
2
2
2
2
0
1
2
3
60
90
120
160
0
0
0
0
3
3
3
3
0
1
2
3
90
130
160
190
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
40
70
110
150
<5
10
200
210
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
70
110
150
190
10
30
230
360
1
1
1
1
2
2
2
2
0
1
2
3
110
150
200
240
30
360
1
1
1
1
3
3
3
3
0
1
2
3
160
200
240
290
续表
阳性管数
MPN
100mL(g)
95%可信限
1mL(g)×3
0.1mL(g)×3
0.01mL(g)×3
下限
上限
2
2
2
2
0
0
0
0
凡乳糖发酵管产气．革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。
5．报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表(见表5—4)，报告每100mL(8)食品中大肠菌群的最可能数。
MPN检索表
阳性管数
MPN
100mL(g)
95%可信限
1mL(g)×3
0
1
2
3
90
140
200
260
30
70
360
370
2
2
2
2
1
1
1
1
0
1
2
3
150
200
270
340
30
70
440
890
2
2
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
210
280
350
420
40
100
470
1500
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
290
360
440
530
3
3
3
3
0
0
0
0
0
1
2
3
230
390
640
950
40
70
150
据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。
24000
48000
注：1.本表采用3个稀释度[1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)]，每稀释度3管。
2.表内所列检样量如改用[10mL(g)、1mL(g)、0.1mL(g)]，表内数字应相应降低10倍；如改用[0.1mL(g)、0.01mL(g)、0.001mL(g)]时，则表内数字应相应增10倍，其余类推。